[发明专利]一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，属于生物检测领域。

背景技术

牛分枝杆菌(Mycobacterium.bovis)及结核分枝杆菌(Mycobacterium.tuberculosis)均可引起牛和人等人畜共患的结核病(Tuberculosis，TB)，前者以感染牛为主，后者以感染人为主，该病被世界动物卫生组织(OIE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。调查表明约10％的人结核病是由牛分枝杆菌引起的，在有结核病奶牛的地区，人的结核病感染率高达75％。全球每年有超过900万的新发结核病病例，近年结核病出现复苏趋势，亚洲和非洲部分国家结核病的发病率和死亡率持续增长。根据卫生部疾病预防控制局2012年统计的数据显示，2012年我国有951508人感染结核病，其中死亡2662人。该病因其易传染，全年均可发生，呈世界性流行，严重危害世界养牛业和人类健康。

结核病主要经呼吸道、消化道感染，目前可以确认，人和牛吸入含有结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的气溶胶是主要感染方式。在养殖场环境中感染结核病的牛可随咳嗽、喷嚏以及呼出的气体将结核菌排出体外，漂浮在空气中，在其活动的环境中形成气溶胶结核菌的污染，健康人及动物吸入后即可感染，严重危害养殖场环境中的人和动物。目前，还没有应用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR技术开展养殖场环境中气溶胶牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的研究报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种采集并快速检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法。本发明的方法可以检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌，并且具有简捷快速、灵敏特异、低廉准确，实用性强等优点。利用本发明的方法可以对养殖场环境中的牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶流行与传播进行实时监测，为养殖场结核病的防控提供技术支持，也可以开展结核病的流行病学调查，为结核病的科学防控提供理论支撑。

针对现有技术中对结核病的研究现状及危害的分析，本发明选择牛分枝杆菌与结核分枝杆菌分泌性蛋白MBP70基因所共有的序列设计合成引物，建立SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，可对养殖场气溶胶中牛分枝杆菌及结核分枝杆菌与其它病原进行区分，并在养殖场中开展结核病的流行病学调查，对养殖场中不同环境中，包括动物饲养舍、运动场、挤奶厅及产房等采集牛分枝杆菌与结核分枝杆菌气溶胶样品，利用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的含量及其分布情况，以期为养殖场人畜共患的结核病传播机制研究提供新的技术手段。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种采集并快速检测养殖场气溶胶中牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的方法，步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

进一步地，采集气溶胶样本的方法为：采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；

进一步地，提取基因组总DNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在室温下12000r/min离心3min，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总DNA，每个样本用50μLddH₂0溶解；

(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH₂O组成；

所述pEASY-T3-MPB70阳性标准质粒是由序列为SEQIDNO.3所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术；

所述特异性引物的序列如下：

MPB70-F：5′-TGACCAGCATCCTGACCTACC-3′(SEQIDNO.1所示)；

MPB70-R：5′-CGGCGTTACCGACCTTGA-3′(SEQIDNO.2所示)；