[发明专利]一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和转基因研究领域，可用于转基因的定向插入和多基因的定向叠加。更具体地讲，本发明涉及一种36bplox特异性重组位点的表达载体，同时涉及到含有lox特异性重组位点表达载体的构建方法，以及该发明在植物转基因和基因工程中的应用。

背景技术

Cre/lox重组系统包括Cre重组酶和lox位点两个部分，Cre重组酶由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，由343个氨基酸组成，它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA序列，如：lox位点，引起重组。

Lox位点是Cre重组酶作用的特异性重组位点，野生的lox位点被称为loxP，由34bp组成，即：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT，两个13bp的反向重复顺序和8bp的间隔区域构成。Cre重组酶有70％的重组效率，不借助任何辅助因子，作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状，甚至超螺旋(被Cre重组酶解螺旋成为线形结构)。Cre重组酶通过与DNA上lox位点的结合，发挥其重组作用(TrinhKR，MorrisonSL2000Site-specificanddirectionalgenereplacementmediatedbyCrerecombinase.JournalofImmunologicalMethods244(1)：185-193.)。

正常loxP是一种回文序列结构，长34bp，由2个13bp的反向重复序列和8bp的非对称间隔序列构成。本发明设计的lox66位点包括1段8bp的非对称间隔序列、1段13bp的反向重复序列、1段13bp的反向重复突变序列及与之相邻的2bp保护序列，杂交实验证明该位点具有正常的重组功能。Lox71位点也存在一个反向重复序列突变位点(YuWC，LambJC，HanFP，BirchlerJA2006Telomere-mediatedchromosomaltruncationinmaize.Proc.Natl.Acad.Sci.103(46)：17331-17336.)，当lox66与lox71发生重组后，形成一个正常的loxp位点和一个具有突变的两个反向重复序列的lox位点，这样就无法进行可逆过程，使得重组发生之后不会回复，为多基因的叠加奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是为了能够提供一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用。

一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，以下步骤：

第一步：MS培养基配方：

铁盐成分：FeSO₄·7H₂O27.8mg/L

Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg/L，

以上溶液均配成100×的母液；

第二步：

筛选培养基：MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar+13mg/L卡那霉素，

生根培养基：MS+0.2mg/LNAA+400mg/LCar+15mg/L卡那霉素，

YEB培养基：牛肉膏(5g/L)，酵母抽提物(1g/L)，蛋白胨(5g/L)，蔗糖(5g/L)，MgSO₄(2mmol/L)pH7.2，固体培养基含琼脂15g/L，

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7.0，再补足水至1L，固体培养基含琼脂15g/L；

第三步：质粒DNA的酶切及其产物的纯化，

第四步：DNA的连接；

第五步：连接产物的重组子鉴定。

本发明的有益效果：含有CRE/loxP位点特异性重组系统的表达载体Cre40的构建及其转基因油菜植株的获得，为未来在油菜中实施多基因叠加并对油菜进行基因工程改良、或利用所得材料作为生物反应器生产目的产品等提供了一种新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1表达载体pBI121质粒图谱。

图2表达载体Cre40质粒图谱。

图3阳性克隆的酶切鉴定。

图4Cre40转基因植株PCR检测结果。

图5内标PDS基因表达。

图6CRE基因表达。

图7Cre40载体重组功能验证