[发明专利]一种肿瘤疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤疫苗及其应用。

背景技术

近年来，随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的迅速发展，以免疫治疗为基础的肿瘤生物治疗被视为是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗模式。与传统的治疗方法不同，肿瘤生物治疗是在不损伤和机体免疫系统和功能的前提下，通过调动肿瘤宿主防御机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。目前生物疗法主要包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗、抗体治疗和肿瘤疫苗技术等。其中，肿瘤疫苗治疗已发展成为一种比较有效的治疗方法，在个体体内注射肿瘤疫苗，可有效减轻患者病情并达到防治高危个体癌症复发的效果。

由于肿瘤的疫苗治疗无明显毒副作用，因而近年来发展很快，目前的肿瘤疫苗主要有以细胞为载体的肿瘤疫苗、单克隆抗体肿瘤疫苗、肿瘤基因疫苗、肿瘤多肽疫苗等。其中，肿瘤细胞为载体的肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的一种重要手段，越来越受到人们广泛重视。然而，由于肿瘤细胞表达抗原的免疫原性较弱，表面MHC分子、共刺激分子表达低下或缺乏，加上肿瘤本身复杂的遗传背景，原始的肿瘤细胞疫苗往往不能诱导很强的免疫应答。为改变这一不足，可采用分子修饰技术改变肿瘤细胞的免疫特性或遗传背景，以提高其免疫原性，诱导更强的免疫应答。因而，研制开发疗效好、应用范围广的肿瘤疫苗已成为目前肿瘤防治研究的一个迫切问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤疫苗及其应用。

本发明提供的肿瘤疫苗，其制备方法依次包括如下步骤：

(1)将特异融合蛋白的编码基因导入离体的肿瘤细胞，得到重组肿瘤细胞；

所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括多聚肽段和B7-1肽段；所述多聚肽段自N端至C端依次包括多聚赖氨酸(具体可为由25-35个赖氨酸残基组成多聚赖氨酸；优选为由30个赖氨酸残基组成多聚赖氨酸)和多聚谷氨酸(具体可为由25-35个谷氨酸残基组成的多聚谷氨酸；优选为由30个谷氨酸残基组成的多聚谷氨酸)；

(2)将所述重组肿瘤细胞进行细胞灭活，得到肿瘤疫苗。

为避免所述多聚肽段和所述B7-1肽段的空间结构彼此影响，所述多聚肽段和所述B7-1肽段之间还可具有连接肽。所述连接肽优选为由4个丙氨酸残基组成的连接肽。

所述特异融合蛋白具体可如序列表的序列1所示。

所述特异融合蛋白的编码基因具体可如序列表的序列2所示。

所述肿瘤疫苗的制备方法中，在步骤(1)和步骤(2)之间还可包括如下步骤：取所述重组肿瘤细胞，用化疗药物进行处理(模拟临床治疗)。所述化疗药物具体可为顺铂(Cisplatin,CDDP)。所述“用化疗药物进行处理”的方式具体如下：①取所述重组肿瘤细胞的细胞悬液，加入顺铂并使其浓度为0.05mg/ml，培养5天后收集细胞，用PBS缓冲液洗涤后培养30天；②完成步骤①后，收集活细胞，用PBS缓冲液洗涤后悬浮，得到细胞悬液；③取步骤②得到的细胞悬液，加入顺铂并使其浓度为0.05mg/ml，培养5天后收集细胞，用PBS缓冲液洗涤后培养30天；④完成步骤③后，收集活细胞，用PBS缓冲液洗涤后悬浮，得到细胞悬液。

所述步骤(2)中，所述细胞灭活具体采用丝裂霉素C进行。所述细胞灭活的具体条件可为：在100μg/ml的丝裂霉素C浓度下培养1个小时。

所述肿瘤疫苗的制备方法具体如下：

(Ⅰ)将所述特异融合蛋白的编码基因导入离体的肿瘤细胞，得到重组肿瘤细胞；

(Ⅱ)用RPMI-1640培养液悬浮所述重组肿瘤细胞，得到活细胞浓度为1×10⁶个/ml的细胞悬液；

(Ⅲ)取步骤(Ⅱ)得到的细胞悬液，加入顺铂并使其浓度为0.05mg/ml，在37℃、5％CO₂的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液洗涤，然后在RPMI-1640培养液中培养30天；

(Ⅳ)完成步骤(Ⅲ)后，收集活细胞，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液洗涤，然后用RPMI-1640培养液悬浮，得到活细胞浓度为1×10⁶个/ml的细胞悬液；

(Ⅴ)取步骤(Ⅳ)得到的细胞悬液，加入顺铂并使其浓度为0.05mg/ml，在37℃、5％CO₂的环境中静置培养5天，然后收集细胞，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液洗涤，然后在RPMI-1640培养液中培养30天；