[发明专利]抑制ER81基因表达的siRNA及其在乳腺癌细胞中的应用

说明书

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，具体地涉及靶向人ER81基因siRNA表达载体的构建、筛选及其在抑制乳腺癌细胞中ER81基因表达水平中的应用。尤其涉及利用siRNA通过RNA干扰途径特异性抑制ER81基因表达及其在杀伤乳腺癌细胞，诱导细胞凋亡方面的用途。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有130万妇女发生乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。其发病率始终处于上升状态，尤以近20年来最为显著。乳腺癌的发生涉及细胞凋亡与增殖失衡、细胞的分化紊乱、癌基因与抑癌基因的功能失调以及相关信号传导系统等多种生命活动的异常。随着现代分子生物学、分子免疫学、肿瘤免疫学、生物工程学研究的迅速进展，人们对乳腺癌的研究已进入了一个活跃阶段。

目前乳腺癌的治疗主要是采取手术为主，辅以化疗、放疗及内分泌治疗等综合方式。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的日趋深入，肿瘤的基因治疗以其治疗的高特异性和相对较低的毒副作用为乳腺癌的治疗开辟了一个新天地。因此，寻找可用于诊断和预后判断的生物标志物，并由此引出新的治疗靶点，是当今肿瘤学研究的重要内容。

基因治疗（gene therapy）是将正常的外源基因导入人体靶细胞或组织以取代有缺陷的基因，通过其正常表达，达到治疗基因病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。目前基因治疗主要涉及恶性肿瘤、心脑血管疾病、遗传病和某些传染病，其中又以恶性肿瘤为主要治疗对象，它为肿瘤治疗开辟了一条新的道路，而且随着研究的深入，基因治疗可能成为从根本上解决肿瘤问题的金钥匙。肿瘤的基因治疗属于一种生物治疗手段，是一大类治疗策略的总称。根据治疗机理不同，目前至少可以分为以下六类：1、免疫基因治疗，治疗基因包括肿瘤相关抗原基因、细胞因子（如 IL -2、 TNF等）基因或者 MHC基因等。2、抑癌基因治疗，体内导入野生型抑癌基因，替代缺失或异常的抑癌基因表达，可以达到抑制肿瘤细胞增殖的效果，目前研究较为深入的抑癌基因治疗主要运用 p53、p16、RB基因等。3、抗血管生成基因治疗，通过基因导入并表达的手段，在体内长期维持一定水平的血管生成抑制因子，抑制肿瘤血管的生成，从而达到抑制肿瘤的增殖、复发和转移。4、调节毒素表达的转基因系统，利用植物或细菌的免疫毒素，如白喉毒素、假单孢内毒素等，将编码正常或变异的毒素基因与单克隆抗体细胞因子或生长因子等连接，将毒素基因导入肿瘤细胞，引起肿瘤细胞的死亡；5、反义癌基因治疗：通过人工合成的寡核苷酸与癌基因编码的mRNA互补结合，可以抑制mRNA的转录，达到封闭癌基因的目的。6、RNA干扰（RNAi）：是指细胞中导入与内源性mRNA某段序列同源的双链RNA（dsRNA），可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象，通过RNA干扰，使与肿瘤细胞生长、转移的相关因子沉默，从而达到抗肿瘤作用。

在正常生物体内，细胞内的双链RNA（dsRNA，38个碱基以上）在依赖ATP的情况下，被核糖核酸酶Dicer切割成双链小干扰RNA（siRNA， 21～25个碱基）。siRNA这个结构对基因沉默效应十分关键。（1）siRNA中有两条链，一条为正义链，一条为反义链，其中反义链可和多种核酸酶结合形成沉默复合物（RISC），同时由于反义链与某一种mRNA的编码区是同源的，因此可与此编码区互补结合，随之引导RISC结合mRNA，然后通过依赖于ATP的解螺旋酶解开siRNA的双链，并将其正义链与靶mRNA置换，即mRNA取代正义链与反义链互补，继而核酸酶将mRNA切割成21～23 nt的小片段，切断部位大约在与siRNA反义链配对序列的中部，于是mRNA发生降解，从而导致基因表达的沉默，干扰了靶基因的表达。（2）RISC中的RdRP（RNA依赖性RNA聚合酶） 以siRNA反义链作为引物，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，然后由Dicer切割产生新的siRNA，新siRNA再去识别新一组mRNA，又产生新的siRNA。经过若干次合成-切割循环，沉默信号就会不断放大，甚至穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。