[发明专利]同型半胱氨酸（Hcy）测定方法及测定试剂盒

说明书

 

技术领域

本发明涉及医学检验测定技术领域，具体涉及一种同型半胱氨酸测定方法及测定试剂盒。

 

背景技术

目前，测定血浆中同型半胱氨酸浓度的方法有很多，包括循环酶法、FPIA法、高效液相色谱法 ( HPLC ）、酶联免疫分析法（ EIA ）等。

1．循环酶法。测定血清Hcy可用于全自动生化分析仪，其反应原理在膦氯化氢(TCEP)作用下氧化型Hcy转化为游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸SAM 催化反应形成甲硫氨酸与S-腺苷同型半胱氨酸SAH。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应，从而放大了检测信号，腺苷立即水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH转化为NAD⁺ ，样本中的Hey浓度与NADH 的变化成正比。测定主要影响因素为血氨，当血氨浓度<5Oumol／L时，Hey测定值与原始值的偏差< 1O% ；当血氨>70umol／L时，测定值与原始值的偏差>10% 。

2．FPIA法。 测定原理是先用二硫苏糖醇将标本中结合态的Hcy还原成游离形式后，同时加入腺苷，在s-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的作用下将Hcy转化为S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，然后加入抗SAH 单克隆抗体和荧光标记的SAH抗原，SAH与荧光标记抗原竞争结合抗SAH抗体，形成大分子的免疫复合物，最后测定其荧光偏振度。此方法要求血标本及时送至实验室，避免血细胞内Hcy的释放对测定结果的干扰。FPIA法测定Hcy具有较好的精密度，其批内CV为1．16% ，批间CV为3．12% ，均小于4% ，与国外文献报道相近。说明方法可靠，血清与血浆结果之间具有良好的相关性。现有多种方法测定Hcy，FPIA法较适合实验室常规应用。

3、高效液相色谱法（ HPLC ) ：是经典的参考方法，但其操作比较复杂，试验耗时比较长，试验数据变异比较大，在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光偏振分析法和酶法所取代。高效液相色谱法：先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光剂进行衍生生成同型半胧氨酸一荧光物质复合物，将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同，因此流动相将其洗脱下来的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物质分开，以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸一荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品／内标的比值进行比较和计算，就可以测定血总同型半胱氨酸的水平。

4、酶联免疫分析法（ EIA ) ：是临床上测定同型半胧氨酸水平的常用方法，操作比较方便、快捷，重复性好，方法稳定可靠。其缺点是大部分操作还是手工操作，比较耗时。

CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量；

CNZO04 10016789.6利用同型半胱氨酸转甲基酶及腺昔同型半胱氨酸酶的循环扩增作用，再加上腺昔脱氨酶、嘿吟核营磷酸化酶、黄嘿吟氧化酶、过氧化物酶等，或腺营脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半胱氨酸含量； 

CNZO0510053210.8利用 L-蛋氨酸 Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之产生硫化氢后再与莹光化合物DMPDZHCI作用产生荧光，该方法使用全自动荧光分析仪测试，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理：用基因重组酶将同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形成可测量的荧光化合物。

 

发明内容

本发明的目的是：提供一种测定同型半胱氨酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的同型半胱氨酸测定试剂盒。具体技术方案如下：

一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，包括以下步骤：

将待测样品与含有丝氨酸、胱硫醚β-合酶、胱硫醚β-裂解酶、乳酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

；

检测主波长 340nm 的吸光度的下降速度，测算出同型半胱氨酸浓度大小。

检测仪器包括Hitachi 7080，Olympus AU400， Beckman LX20， Abbott Aeroset； Toshiba 120FR，Mindray BS-200，Dimension AR自动生化分析仪等。

一种同型半胱氨酸测定试剂盒，它由下述试剂组成：  

        试剂1：