[发明专利]基因工程改造蛋白酶K及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种基因工程改造蛋白酶K及其生产方法。

背景技术

目前，蛋白酶K的生产主要有两条路径，一是直接从真菌中直接提取，二是通过基因重组后表达。国内蛋白酶K产品主要依靠进口和真菌中直接提取，直接提取所需周期较长，以现有科技水平大概需要20天左右；而基因重组表达需要前期进行大量的研发，如果能够表达成功则可以将生产周期缩短至3～4天。从长远发展和大规模生产的角度考虑，优选进行基因重组后表达。因此，有必要采用基因重组技术并通过基因的合成与突变改造，构建了高效表达载体，通过高密度发酵实现了重组蛋白酶K的工业化生产，进而取代进口产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因工程改造的蛋白酶K，其酶活性为同种天然蛋白酶活性2倍以上，能够将生产周期缩短至3～4天，极大的提高了生产效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案进行实施：

基因工程改造蛋白酶K，其特征在于：将如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列在如下位点进行相应的突变：

N95C,P97S,S107D,S123A,I132V,E138A,M145F,Y151A,V167I,L180I,Y194S,A199S,K208H,A236V,R237N,P265S,V267I,S273T,G293A,L299C,I310K,K332R,S337N和P355S。

通过合成与扩增获得蛋白酶K基因，然后通过克隆，转化，将蛋白酶K基因整合到酵母染色体上，通过酵母的筛选，选出能够高效表达目标蛋白的优质菌株，利用高密度发酵技术，进行高密度发酵表达蛋白酶K，然后经过蛋白质的分离纯化，获得高纯度高活性蛋白酶K。

附图说明

图1为目的基因检测结果；

图2为检测蛋白水平结果；

图3为酶活测定Sigma-Aldrich结果；

图4为酶纯度测定(SDS-PAGE)结果；

图5为酶稳定性实验结果；

图6为蛋白电泳比较实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、目的基因的获取

采用基因重组技术并通过基因的合成与突变改造，构建了高效表达载体；

氨基酸突变点包括：N95C,P97S,S107D,S123A,I132V,E138A,M145F,Y151A,V167I,L180I,Y194S,A199S,K208H,A236V,R237N,P265S,V267I,S273T,G293A,L299C,I310K,K332R,S337NandP355S；

其中：N95C中N为原始氨基酸，95为蛋白序列中该氨基酸位置，C为突变后的氨基酸)；

蛋白酶K氨基酸序列，亦即SEQIDNO.1为：

MRLSVLLSLLPLALGAPAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDHVYKNVFSGFAATLDENMVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTINAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

二、高效表达载体的构建

合成后利用SalI酶切后线性化连接到pPIC3载体上，通过电转化到毕赤酵母细胞中，为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株，巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。利用PCR方法鉴定高拷贝的菌株，如附图1所示；

三、高效表达载体的诱导表达