[发明专利]一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术

碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2，简称PGL)，全称聚半乳糖醛酸裂解酶，在碱性条件下具有高活性，可以利用反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，将果胶质分解为不饱和的寡聚半乳糖醛酸。该酶广泛存在于细菌、酵母菌、真菌、植物以及和某些寄生线虫。不同来源的碱性果胶酶同源性差异较大。碱性果胶酶广泛应用于食品、纺织、造纸、环境、生物技术等各个领域，在茶和咖啡发酵、纺织和植物纤维加工、油提取、含果胶工业废水处理等发挥巨大作用。

在棉纤维初生细胞壁的最表面含有很多伴生杂质，如：果胶质、蜡质、含氮物质以及蛋白质等非纤维素类物质，互相包结成为复杂庞大的疏水网状结构。纺织工业中包含精炼步骤，其目的就是去除棉纤维上的杂质，提高棉织物的吸湿功能性，再进行后续加工。传统的化学纺织精炼方法即热碱法，其需要消耗大量的化学品与水资源，环境污染严重，据统计，印染过程中约70％的废水是在这个步骤中产生的。除此之外，热碱处理将对纤维造成严重损伤，机械强度将大幅下降。

近十几年来，随着分子生物学与工业微生物研究的迅猛快速发展，研究者开始采用基因工程手段构建重组菌，以期实现碱性果胶酶的过量重组表达。目前，已相继出现了利用Escherichia coli、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等作为宿主表达不同来源果胶酶基因的报道。现在对碱性果胶酶的研究主要集中于合成碱性果胶酶工程菌与发酵过程控制。尽管PGL的表达量很高，但是酶的催化效率耐热性等酶学特性还有待进一步改进，而目前所做的分子改造也只是尝试不同宿主异源表达，提高酶活、耐热性、催化效率等酶学性质方面的研究，目前国内做的甚少。近十年，国外碱性果胶酶的研究方向集中到酶的分离纯化、酶学特性及其蛋白质结构特征研究等方面，我国对碱性果胶酶的研究主要集中在菌种选育、发酵工艺和应用工艺的改良方面，而我国尚缺效价很高的商品碱性果胶酶，为进一步实现工业化铺垫，这方面的研究不容忽视。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种耐热性提高的碱性果胶酶突变体。所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的碱性果胶酶(野生型)为基础，将第325位的异亮氨酸I点突变为苯丙氨酸F。

本发明要解决的第二个技术问题是提供构建所述碱性果胶酶突变体的方法，是通过设计引物对编码碱性果胶酶的基因进行定点突变后表达。

所述构建方法，优选以质粒pET-20b(+)-pgl为模板设计引物进行突变并将突变后的质粒转化进入E.coli JM109进行扩增，然后以E.coli BL21(DE3)表达含突变基因的重组质粒，得到热稳定性增强的碱性果胶酶突变体。

所述pET-20b(+)-pgl的构建方法参见文献：Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach.2011,Shuying Fang et al.Volume102,Issue22,p10671–10678。

所述用于定点突变的引物是：

pglI325F primer1：5'-CTATGCCCAAAACAATGTCTTCGACGTACCGGGACTGTCAG-3'

pglI325F primer2：5'-CTGACAGTCCCGGTACGTCGAAGACATTGTTTTGGGCATAG-3'。

本发明要解决的第三个技术问题是提供应用基因工程菌发酵生产所述碱性果胶酶突变体的方法，是将含有编码突变碱性果胶酶的基因的重组菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-pglI325F)活化培养后接种到含有100μg mL^-1氨苄青霉素的发酵培养基中，装液量为50mL/500mL，于37℃，200r mi^n-1培养；菌体生长到OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度0.4mMIPTG进行诱导，同时将温度调整为30℃，诱导发酵48h。