[发明专利]使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化

权利要求书

1.人源化兔免疫结合剂的方法，所述兔免疫结合剂包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列和/或轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，所述方法包括：

(i)将由CDR H1、CDR H2和CDR H3序列组成的组中的至少一个重链CDR移植入人重链受体构架，所述人重链受体构架与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并包含下列氨基酸中的至少4个：AHo编号下的位置24处的苏氨酸(T)、位置56处的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置84处的苏氨酸(T)、位置89处的缬氨酸(V)和位置108处的精氨酸(R)，和

(ii)将由CDR L1、CDR L2和CDR L3序列组成的组中的至少一个轻链CDR移植入与SEQ ID NO:2具有至少85％的同一性的人轻链受体构架。

2.权利要求1的方法，其中

(i)人重链构架包含SEQ ID NO:4的构架氨基酸序列；和

(ii)人轻链构架包含SEQ ID NO:2的构架氨基酸序列。

3.权利要求1的方法，其中

(i)人重链构架包含SEQ ID NO:4的构架氨基酸序列；和

(ii)人轻链构架包含SEQ ID NO:9的构架氨基酸序列。

4.权利要求1-3任一项的方法,其还包括用参与抗原结合的兔免疫结合剂的构架残基置换构架残基。

5.权利要求1-4的任一项的方法，其还包括用在AHo编号下的重链氨基酸位置12，103和144中的至少一个位置处的残基来置换重链受体构架的构架残基的步骤。

6.权利要求1-5的任一项的方法，其还包括用选自下列的在根据AHo编号系统的轻链可变区的位置1，3，4，10，47，57，91和103中的至少一个位置处的增强稳定性的残基来置换轻链受体构架的构架残基的步骤：(a)位置1处的谷氨酸(E)、(b)位置3处的缬氨酸(V)、(c)位置4处的亮氨酸(L)、(d)位置10处的丝氨酸(S)、(e)位置47处的精氨酸(R)、(e)位置57处的丝氨酸(S)、(f)位置91处的苯丙氨酸(F)和(g)位置103处的缬氨酸(V)。

7.根据权利要求1-6的任一项的方法人源化的免疫结合剂。

8.权利要求7的免疫结合剂，其中靶抗原是VEGF或TNFα。

9.权利要求1-6的任一项的方法，其中所述方法还包括按照下列步骤鉴定通过B细胞产生的抗体可变结构域的供体CDR：

a)将兔B细胞与靶抗原一起温育；

b)选择结合靶抗原的那些B细胞；和

c)鉴定由B细胞产生的抗体可变结构域的CDR。

10.权利要求9的方法，其中所述B细胞分离自用所述靶抗原免疫的兔。

11.权利要求9或10的任一项的方法，其中对所述B细胞和靶抗原进行差异染色，然后通过基于流式细胞术的单细胞分选来阳性选择两种染色的共发生。

12.权利要求9-11的任一项的方法，其中所述靶抗原是可溶性蛋白质。

13.权利要求9-11的任一项的方法，其中所述靶抗原在细胞的表面上表达。

14.权利要求13的方法，其中通过用细胞内荧光染料染色表达靶抗原的细胞来间接染色靶抗原。

15.权利要求9-14的任一项的方法，其中用一种或多种特异于B细胞表面标志物的经标记的抗体染色B细胞。

16.权利要求9-15的任一项的方法，其中用标记的抗IgG抗体染色B细胞。

17.权利要求16的方法，其中用标记的抗IgG抗体和用差异标记的抗IgM抗体染色B细胞。

18.权利要求17的方法,其中阴性地选择用标记的抗IgM抗体染色的所述B细胞。

19.权利要求9-18的任一项的方法，其还包括培养权利要求9的步骤b)中选择的所述B细胞的步骤，以便所产生的抗体分泌入培养基中，任选地在辅助细胞系存在的情况下。

20.权利要求19的方法，其还包括就对靶抗原的特异性结合测试所述分泌的抗体的步骤。