[发明专利]通过发酵过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸和该二肽的衍生物的微生物和方法

说明书

技术领域

本发明涉及适于过量生产γ-谷氨酰半胱氨酸(γGC)和该二肽的衍生物γ-谷氨酰胱氨酸和双-γ-谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，以及用于制备这些化合物的方法。 

背景技术

γ-谷氨酰半胱氨酸是通过连接氨基酸L-半胱氨酸和L-谷氨酸而形成于原核和真核生物细胞中的二肽。 

双-γ-谷氨酰胱氨酸是通过两分子的γ-谷氨酰半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。该反应是可逆的，这意味着，通过还原(例如酶法或化学法)，双-γ-谷氨酰胱氨酸可以转化回γ-谷氨酰半胱氨酸。 

γ-谷氨酰胱氨酸是通过一分子的γ-谷氨酸半胱氨酸和一分子的L-半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。该反应是可逆的，这意味着，通过还原(例如化学法)，γ-谷氨酰胱氨酸可以转化回γ-谷氨酰半胱氨酸和L-半胱氨酸。 

巯基化合物γ-谷氨酰半胱氨酸在很多生物中作为谷胱甘肽的前体。谷胱甘肽生物合成的第一步是通过ATP-依赖性酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶连接L-半胱氨酸的α-氨基和L-谷氨酸的γ-羧基之间的γ-肽键。此外，由于酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被谷胱甘肽抑制，该反应是谷胱甘肽生物合成的限速步骤。谷胱甘肽生物合成的第二步是L-甘氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸反应以产生谷胱甘肽，其中L-甘氨酸通过α-肽键和γ-谷氨酰半胱氨酸的半胱氨酰官能团连接。该ATP-依赖性的反应也同样由酶谷胱甘肽合成酶催化。 

由于其抗氧化的特性，谷胱甘肽在细胞中起关键作用，并且作为还原剂、辅底物、辅因子参与很多细胞过程。然而，也已知存在谷胱甘肽缺陷的生物，其中所述谷胱甘肽前体γ-谷氨酰半胱氨酸发挥谷胱甘肽的生物学 作用。已知的实例是诸如盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)(Sundquist and Fahey,1989,J.Biol.Chem.264:719-725)的典型嗜盐古细菌。 

此外，在文献中描述了各种菌种的不同谷胱甘肽缺陷微生物菌株，如酿酒酵母(Grant et al.,1997,Mol.Biol.Cell.8:1699-1707)、集胞藻(Synechocystis sp.)(Cameron and Pakrasi，2011,Plant Signal.Behav.6:89-92)或大肠杆菌(Fuchs and Warner,1975,J.Bacteriol.124:140-148)。这些菌株在相应的编码谷胱甘肽合成酶的基因中具有突变或缺失(例如，大肠杆菌和集胞藻的gshB或者啤酒酵母的gsh2)。通过谷胱甘肽合成酶活性的改变或缺失，这些菌株不再能或仅能在一定程度上合成谷胱甘肽。因此细胞γ-谷氨酰半胱氨酸水平提高。由于增强的形成和提高的浓度的现存γ-谷氨酰半胱氨酸承担了很多谷胱甘肽特异性功能，这些突变菌株是有生存能力的。然而，相比对应的野生型菌株，这些菌株的特征在于对活性氧和重金属离子的增加的敏感度，使得其生长部分被损害(Cameron and Pakrasi,2011Plant Signal.Behav.6:89-92；Helbig et al.,2008,J.Bacteriol.190:5439-5454)。 

活性氧、重金属离子和外源化合物(xenobiotic)的解毒频繁发生在许多生物中，也在人类中，尤其通过谷胱甘肽的方式(Grant et al.,Mol.Biol.Cell.8:1699-1707)。此外，较低的谷胱甘肽水平通常是诸如自闭症、帕金森病、囊性纤维病、HIV、癌症或精神分裂症的各种疾病的症状和/或基础(Wu et al.,2004,J.Nutr.134:489-492)。因此，对维持恒定的细胞内谷胱甘肽水平甚至提高其水平存在相当大的关注。γ-谷氨酰半胱氨酸已被成功测试作为用于提高细胞谷胱甘肽水平的有前景的物质(Anderson and Meister,1983,P.N.A.S.80:707-711)。 

WO2006102722描述了用于制备γ-谷氨酰半胱氨酸的酶促法，这是基于半胱氨酸衍生物和γ-谷氨酰半胱氨酸供体的反应，通过固定的γ-谷氨酰半胱氨酸转肽酶。