[发明专利]与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学技术领域，特别涉及一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物对直肠癌早期筛查的应用。

背景技术

结直肠癌是第三常见的恶性疾病和癌症致死的第二主要原因。就如其他恶性疾病一样，基因因素是导致结直肠癌形成的重要原因，但是，只有20％的结直肠癌病例可以追溯到家族性基因变异。事实上，大部分的散发性结直肠癌和环境因素密切相关，最常见的抑癌基因APC的突变导致了Apc/GSK3β/Axin复合物的破坏，从而激活了Wnt/β-catenin信号转导通路。Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活不仅促进小肠上皮细胞的增殖，也抑制了其向腺窝底部的迁移和凋亡。典型的“结直肠癌发生的基因途径”已经被充分的研究，环境因素导致结直肠癌发生的最新机制和慢性炎症有关，称为肠炎相关性结直肠癌(CAC)。近几年来随着中国人的饮食和生活方式的改变，结直肠癌的发生率迅速增高，而且大部分的结直肠癌病例和慢性肠炎相关。临床上已经发现，肠炎相关性结直肠癌往往伴随着慢性肠炎疾病，例如克罗恩病，溃疡性肠炎。流行病学和临床研究表明，在伴随慢性肠炎30年后，溃疡性肠炎增加了18-20％的肠炎相关性结直肠癌的发病率，而克罗恩病增加了8％的发病率。在小鼠模型中，注射致癌物azoxymethane(AOM)和慢性肠炎诱导物DSS会导致多发的肠肿瘤，但是如果没有炎症的存在，则需要注射多倍剂量的AOM并需要更长时间才能导致肿瘤的形成。这些临床和实验结果表明，CAC是典型的炎症致癌。但是，不像Apc/Wnt/β-catenin信号转导通路，肠炎相关的结肠直肠癌的发病机制，特别是肠炎恶性转变的机制尚不清楚，主要是因为缺少动态研究的合适模型。小肠上皮组织的杯状细胞能够分泌一层黏液蛋白，这层黏液蛋白能够保护上皮组织免受机械的和化学的损伤，以及炎症因素的损害。这种黏液蛋白主要是由Muc2基因所编码。已有研究表明，杯状细胞的减少和Muc2的表达降低在溃疡性肠炎和结直肠癌中非常常见。MUC2对于维持肠道稳态非常重要，将小鼠的Muc2基因敲除后，肠上皮细胞的增殖、迁移和凋亡都发生了改变，最重要的是，Muc2敲除小鼠能够自发地导致小肠、大肠和直肠肿瘤的发生。而研究发现肿瘤的发生与慢性炎症相关，与Wnt/β-catenin信号通路无关。Muc2敲除引起的炎症促进了Apc突变小鼠的肿瘤发生，而且在Muc2敲除小鼠中，周期依赖性激酶抑制物p21WAF1的表达降低促进了肿瘤的形成。我们更深入的研究发现，Muc2敲除小鼠在出生后3个月以内会自发形成慢性肠炎，其组织病理特点与人的溃疡性肠炎类似。在3个月之后，Muc2-/-小鼠会形成结肠和直肠肿瘤。因此，3个月可能是慢性肠炎发展为结直肠癌的关键时间点。所以Muc2-/-小鼠可以作为一种动态研究慢性肠炎恶性转变形成结直肠癌的理想模型。为了揭示肠炎恶性转变的分子机制，我们分离了Muc2-/-小鼠的肠上皮细胞来做miRNA，我们在肠炎恶性转变的关键时间点发现了一些异常表达的miRNA。我们在人的肠炎和结直肠癌组织中对上述的一些miRNA做了验证，有趣的是，这些表达降低的miRNA在小鼠组织中同样表达降低，并且和一些细胞因子的表达增高相关，这些发现预示着表观改变可能在肠炎恶性转变中起着重要的作用。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物和试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供一种与结直肠炎恶性转变相关的miRNA标志物，该标志物为miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p和miR-150-5p的组合。以上四种miRNA在Muc2-/-小鼠模型的慢性肠炎恶性转变过程中表达明显降低，在人肠炎组织及结直肠癌组织中表达也明显降低，说明其与慢性肠炎恶性转变密切相关。

本发明还提供一种上述miRNA标志物的引物，该引物为：

miR-138-5p的正向引物序列为：5’-TGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3’，如SEQ ID NO：1所示；

miR-145-5p的正向引物序列为：5’-GGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

miR-146a-5p的正向引物序列为：5’-TTCGGTGAGAACTGAATTCCA-3’，如SEQ ID NO：3所示；

miR-150-5p的正向引物序列为：5’-CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA-3’，如SEQ ID NO：4所示；