[发明专利]基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法

说明书

技术领域

本创新发明涉及全新的核酸等温扩增法，在Bst DNA 聚合酶作用下基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法，可用于细菌、病毒等各种基因的检测领域，此方法不仅可以应用于核酸定性、定量检测等，未来还可能应用新基因的合成，从而应用于医药。

背景技术

一直以来，病原微生物的体外培养是病原体诊断的“金标准”。据微生物学家的估计，采用目前的培养技术，仅有约1%的细菌可以培养。在过去的一个世纪里，以聚合酶链反应（PCR）为代表的基于核酸的检测技术发展迅速，为其他病原体的精确检测诊断提供了可能。毋庸置疑，Kary Mtlllis发明的PCR技术是20世纪80年代分子生物学领域的一项革命性突破。也许他本人当时也没有想到，PCR技术会在分子生物学、医学、法学等领域发挥如此重要的作用。经过几十年的改进，PCR方法已从定性发展为定量，能够在几个小时内，从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段，而且特异性也有了极大的提高。然而，从PCR技术的诞生之日起，它始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以PCR为基础的核酸扩增检测技术无法更广泛地推广和应用。

基于这种强烈的需求，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛运用。特别是在临床和现场（point－of－care）快速诊断技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。

90年代未核酸等温扩增技术不断涌现发展，包括核酸序列的扩增技术（NASBA），自动维持序列扩增（3SR）、链置换扩增技术（SDA）以及环介导等温扩增技术。现有最主要的等温扩增技术就是环介导等温扩增（可参见其相关专利ZL 00818262.0，ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7），它效率较高，但引物结构较复杂。

发明内容

一种基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法，所设计的不同引物在Bst DNA聚合酶作用下，可以在等温条件下高特异性、高效和快速地完成DNA扩增。其特征在于：基因可以通过跳跃复制完成扩增，从而提高了基因扩增的反应效率，引物与目标DNA结合后并不完全按照DNA序列进行互补延伸扩增，而是在扩增过程中发生了跳跃扩增，导致扩增产物片段与预期产物片段不一致，即与其他核酸扩增方法扩增产物不一致。也就是说其扩增产物与PCR、LAMP、LIMA等扩增方法生成的扩增产物均不一致。这些方法引物在与目标DNA结合后都是沿着目标DNA复制延伸，而在本发明中引物在与目标DNA结合后并未完全沿着目标DNA复制延伸，导致扩增产物片段与预期产物片段不一致。

通过电泳及测序结果表明扩增产物主要是正向引物和反向引物互补序列通过几个碱基链接而成的单体及多个由单体串联形成的多聚体，这些链接引物的碱基与所设计的引物结构中目标DNA的片断并不完全一致，导致本发明中扩增产物片段与其他核酸扩增方法扩增产物片段不一致（扩增产物与预期产物片断不一致）。具体内容如下：以DNA双链（见图1）为模板设计多种引物结构均可实现核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法。

核酸扩增引物设计核心结构如图2、图3、图4、图5、图6所示，结构中F₀引物是变值，但最好不能引起二聚体的任何一定长度的引物片段，每个F₀均是独立的，两个F₀可以设计为相同碱基序列也可以取不同碱基序列。F₀当然可以设计成目标反应区域任何DNA分子片段。

核心结构已是扩增反应的充分条件，加入引物可能起到加快反应的作用，当然F₀取值不同，可能形成更多的反应路径，也就是引物可以和更多的结构反应，我们发明的是能扩增出新产物的核酸等温扩增新方法，只要核心反应机理存在，引物设计结构就是可行的，所有的设计结构包括变通结构都是我们的保护范围，在此可能发生的其它反应机理不再一一列举了。

应用实例一：

按图2引物结构设计引物，以检测结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis H37Rv complete genome GenBank: AL123456.3）DNA片段为例：