[发明专利]一种三角板形核酸纳米制剂及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种包含siRNA的三角板形核酸交联自组装纳米结构的制剂，尤其涉及一种三角板形核酸纳米制剂及制备方法和应用。

背景技术

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)作为RNA干扰发挥效应的关键，可高效、特异地抑制靶基因mRNA翻译过程，实现靶基因的表达下调，目前siRNA成为一种应用于各种人类疾病的基因治疗研究具有临床应用价值的有力工具，其发挥作用的关键在于siRNA本身的性质以及能否高效转染细胞与靶细胞结合。如何促进细胞摄取，保证运输过程中siRNA的稳定性是目前急需解决的问题。

siRNA稳定性差，不易被细胞摄取的重要原因有：RNA分子对核酸酶高度不稳定，导致其半衰期短暂；其聚阴离子性质也导致其不易为细胞摄取；同时其电荷密度导致其充分水化，不易与一些蛋白相互作用而被迅速清除。目前研究经常是通过化学修饰，如应用锁核酸、4-硫代核糖核苷等核糖修饰可以增强siRNA抵抗核酸酶的降解能力，或者磷酸链的变化也可以提高siRNA的抗核酸酶作用，但一些研究表明大量磷酸酯键修饰有细胞毒性；siRNA的碱基修饰虽能提高其稳定性，也会造成干扰活性降低。本发明的三角板形核酸纳米制剂属于双螺旋结构修饰，使siRNA双螺旋化，完全避免了核酸酶的降解，并且siRNA片段形成纳米环结构，不但可以保持RNA干扰活性，同时提高siRNA的细胞摄取效率。

核酸自组装纳米载体携带的目标主要是具有研究或治疗用途的药物或基因。核酸纳米载体由于具有较高的可编程性、较好的生物稳定性和生物相容性，不会导致细胞异常转化或死亡，而且具有纳米粒子特殊的结构和表面电荷，能较好的被细胞摄取，并将释放交联系统中的siRNA，使其具有较高的转染效率。基于核酸自组装纳米载体的多种优势，其在基因研究和治疗中也得到了不断的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种三角板形核酸纳米制剂，该制剂对肺癌细胞的转染效率显著提高，能有效抑制肿瘤细胞的生长。

本发明的技术方案是：

一种三角板形核酸纳米制剂，该制剂包括DNA-RNA交联构成三角板形自组装纳米制剂。

所述的三角板形自组装纳米制剂由RNA序列如SEQ ID NO：1所示的mTOR siRNA、DNA序列如SEQ ID NO：2所示的mT-2A和DNA序列如SEQ ID NO：3所示的mT-1A3通过单链核酸分子碱基互补配对的自组装纳米制剂。

所述的三角板形自组装纳米制剂中mTOR siRNA、mT-2A和mT-1A3的摩尔比为3∶3∶1。

三角板形核酸纳米制剂的制备方法有以下步骤：

1)取mTOR siRNA、mT-2A和mT-1A3的冻干干粉，分别加H₂O稀释，混匀，得到mTOR siRNA、mT-2A和mT-1A3溶液；

2)取mTOR siRNA溶液加入等体积的mT-2A溶液，放入90℃水浴中自然冷却至37℃，随后加入mT-1A3溶液，充分混匀，37℃水浴30min，室温下放置30min，4℃放置20min，得到mTOR siRNA、mT-2A和mT-1A3的摩尔比为3∶3∶1的用于治疗肺癌的制剂。

本发明所述的制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。

三角板形核酸纳米制剂分子量为95，040。

本发明的三角板形核酸纳米制剂通过单链核酸分子碱基互补配对(adenine简写A，代表腺嘌呤；cytonine简写为C,代表胞嘧啶；guanine简写为G，代表鸟嘌呤；thymine简写T，代表胸腺嘧啶；uracil简写为U代表尿嘧啶；其中A可以与T或U互补配对，G和C互补配对)进行纳米组装。DNA作为三角板形支撑骨架位于各条边，siRNA位于三角板形的三个角，单一功能性三角板形核酸纳米结构可靶向递送三个siRNA的DNA纳米粒子(参见图1)。与其它的药物运输载体相比较，三角板形核酸纳米制剂具有以下优点：1)核酸是生物相容性材料且易于功能化修饰，应用其作为药物载体可以降低细胞毒性。2)核酸分子标记方法多样，对示踪研究药物的途径和机理提供了较大的便利。3)合成过程简单，核酸的变性和复性容易受温度的控制，其自组装具有较强的可操控性。4)裸露siRNA进入细胞容易被核酸酶降解，三角板形核酸纳米制剂中的siRNA与DNA结合，提高siRNA稳定性，具有一定的缓释作用；5)在三角板形核酸纳米制剂的基础上，具有核酸的基本性质，可以继续与目前国内外报道的药物运输载体结合，如类脂、脂质体、合成多聚体等，有利于细胞的摄取。