[发明专利]B型尿钠肽检测试剂盒及其制备

说明书

技术领域

本申请涉及一种基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒及其制备。

背景技术

B型尿钠肽(BNP)是一种心脏神经激素，在血容量增加和压力负荷增加时反应性的从心室分泌。血浆BNP是近来研究较多的化学因子，BNP水平的升高可反映左室舒张末压的升高，收缩功能不全和舒张功能减低引起的心力衰竭均有此改变，对于心力衰竭的诊断有很大的意义。同时，BNP升高的水平与心力衰竭的NYHA分级存在正相关性，LVEF降低的患者，LVEF越低，BNP水平升高的越显著，对于心力衰竭的进展和近期及长期心性预后有很好的预测价值，BNP水平持续升高，心性事件发生率和心性死亡率升高，预后较差，经治疗后BNP降低的患者，预后可能会改善。

B型尿钠肽的常用检测有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，免疫比浊法随着全自动生化仪的普及而普及。但传统免疫比浊法的检测灵敏度仍然不能达到临床要求，于是出现了乳胶颗粒增强免疫比浊法。乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是，首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。然而，乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，干扰试验结果，且乳胶制造成本较高，导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法，如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合，以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了，表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。本发明研究表明，许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求，比如：氧化铁等磁性纳米颗粒在40nm以上时由于顺磁性和比重等因素而容易聚沉无法达到应有的稳定性；金纳米颗粒在粒径80-150nm的范围内稳定性太差而不合适等。根据中国专利CN102749454的教导，本发明以直径为35nm-60nm的胶体金颗粒进行试验，发现，灵敏度较差，无法满足临床中对灵敏度小于1ng/mL的要求，和最低检测限5ng/mL的要求，且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间，因此常常造成假阴性的结果；同时还存在反应时间长(平衡时间5-10min)，无法达到快速检验的要求。

发明内容

为了克服现有技术存在的错误教导，解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高，反应快捷，制造成本低，反应后不产生沉淀，方便生化仪清洗。

根据本发明的一方面，提供一种基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了B型尿钠肽抗体的金纳米颗粒的溶液，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，优选67.2nm-72.4nm；所述金纳米颗粒和抗体质量比在50：20–60，优选50：40-60。

具体来讲，所述试剂R2为PH值5.0-9.5，优选6.0-8.5的溶液。

进一步地，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，促凝剂为重量体积比0.4％以内的PEG20000，稳定剂为重量体积比2％以内的BSA，蔗糖的重量体积比为20％以下，甘油的重量体积比为20％以下。

作为优选，上述R2为含有粒径为72.4±1.5nm且标记了B型尿钠肽抗体的金纳米颗粒、重量体积比20％蔗糖、重量体积比0.2％PEG20000、重量体积比0.5％BSA和重量体积比5％甘油的，pH7.2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗粒和抗体的重量比为50：40-60。

更进一步地，所述基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒还包括起缓冲和稳定作用的试剂R1，所述试剂R1为含有重量体积比0.2％BSA、重量体积比0.1％的NaN3和重量体积比0.05％Tween20的，pH7.2的磷酸盐缓冲液。在本发明的试剂盒中，发明点主要在试剂R2，试剂R1也可以使用现有免疫比浊法中检测试剂盒的试剂R1。

上述试剂R2通过如下方法制备：

制备金纳米颗粒；