[发明专利]一种表达猪端粒酶反转酶转座子载体及其构建方法与在建立猪永生化细胞系中的应用

权利要求书

1.一种表达猪端粒酶反转酶的转座子载体，是由SB转座子重复序列IR/DR、猪蛋白翻译延伸因子1a(EF-1a)启动子、猪端粒酶反转酶(TERT)cDNA和生长激素基因polyA序列组成。

2.权利要求1所述的表达猪端粒酶反转酶的转座子载体在猪永生化细胞系建立中的应用。

3.权利要求1所述的表达猪TERT转座子载体的构建方法，其步骤如下：

(1)用聚合酶链式反应扩增猪EF-1a启动子和生长激素基因polyA序列，插入SB转座子载体pT2/HB，获得稳定表达载体pTEG；

(2)用反转录PCR扩增猪TERT cDNA，插入pTEG载体获得重组载体pTEG-TERT。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)是：用猪EF-1a启动子驱动永生化基因稳定表达；步骤(2)是：以猪TERT cDNA作为猪源细胞的永生化基因，以SB转座子介导永生化基因整合。

5.权利要求2所述的表达猪TERT转座子载体在猪永生化细胞系建立中的应用，其具体方法如下：

(1)用转座子载体pTEG-TERT和转座酶载体pSB16共转染猪原代细胞，用有限稀释法获得单细胞克隆；

(2)用PCR分别检测细胞克隆的抗性基因和猪TERT基因表达盒，排除重组载体随机整合的细胞克隆，保留转座子介导猪TERT基因表达盒整合的细胞克隆；

(3)对目的细胞克隆进行反复传代，获得永生化细胞系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)是：猪TERT永生化的细胞为非转化正常细胞；步骤(2)是：筛选的细胞克隆不含抗性基因和病毒序列。