[发明专利]一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白聚合能力的方法

权利要求书

1.一种检测α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的试剂盒，试剂盒中包括以下试剂：重组人α-突触核蛋白，抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1B2。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，试剂盒中还包括生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1B2。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，根据需要，所述试剂盒还可包括以下辅助试剂：

碱性磷酸酶，或亲和素标记的碱性磷酸酶

对硝基酚磷酸显色液

ELISA酶标板

磷酸盐缓冲液

NaHCO₃缓冲液

封闭液

PBST。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中

磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，

NaHCO₃缓冲液的浓度为200mmol/L，pH9.6,

封闭液的浓度为2.5％，

PBST为含0.05％Tween-20的0.01M PBS。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中各试剂分别包装，每个包装装入试剂的量以够一个样本使用量为基本量，可以扩大到10个，100个，1000个样本的使用量。

6.抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1B2，其制备方法如下：

步骤1，重组蛋白抗原的制备：制备并纯化人全长α-突触核蛋白作为抗原，

步骤2，免疫小鼠：使用福氏完全佐剂进行第一次免疫，用福氏不完全佐剂进行随后的免疫，乳化重组人α-突触核蛋白，每隔2周对BALB/c雌性小鼠进行免疫，50μg抗原/次/小鼠，抽取动物血清，利用ELISA与Western blot方法检测其效价与特异性，

步骤3，筛选杂交瘤细胞株：选取血清效价高的小鼠，取出其脾细胞，在存在聚乙二醇4000的条件下与小鼠骨髓瘤细胞Sp2融合，随后使用HAT培养基对融合的产生抗体的杂交瘤细胞进行选择培养，最后用ELISA方法筛选可以产生特异性抗体的杂交瘤细胞，ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞进一步利用免疫组化与免疫印迹法鉴定所筛选杂交瘤细胞产生抗体的特异性，经筛选，克隆号为1B2的杂交瘤细胞可以产生特异性抗人α-突触核蛋白抗体，1B2的杂交瘤细胞经过2次亚克隆进行纯化后，在冷冻保护液的保护下与液氮中长期保存，

步骤4；抗体制备：将1B2杂交瘤细胞从液氮中复苏，并用杂交瘤培养基在培养箱中大量扩增，收获细胞，将细胞由腹膜内注射入BALB/c裸鼠体内，产生腹水，收获腹水，利用protein A亲和层析纯化法获得纯化的1B2鼠抗人α-突触核蛋白单克隆抗体，定量、分装、保存。

7.生物素化的抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1B2，其制备方法如下：

步骤1，用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，

步骤2，用0.1mol/L,pH8.8硼酸盐缓冲液配制浓度为1～3mg/ml的抗体1B2溶液，若抗体1B2储存时加入了叠氮钠，则标记前须先在硼酸盐缓冲液中充分透析以除去叠氮钠，

步骤3，按25～100μg/mg的比率将生物素酯加入抗体1B2中，混合均匀并在室温下孵育4h，

步骤4，每250μg生物素酯内加入20μl 1mol/L的氯化铵，室温孵育10min，

步骤5，将抗体1B2溶液用PBS或其他所需的缓冲液透析，以除去未结合的生物素，

步骤6，按纯化抗体的储存方法保存标记抗体。

8.一种用权利要求1的试剂盒检测α-突触核蛋白在血浆中的寡聚体形成率的方法，包括以下步骤：

(1)分离血浆；

(2)加入重组人α-突触核蛋白，振荡孵育，得到寡聚体；

(3)抗人α-突触核蛋白单克隆抗体1B2和寡聚体反应，随后加入碱性磷酸酶和显色剂，进行显色；

(4)用分光光度法对显色的样品进行吸光度测定，根据标准曲线计算样品中寡聚体的形成率。