[发明专利]一种检测受实验者体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰能力的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白形成能力的方法，该方法可用于帕金森病的诊断。 

背景技术：

帕金森病是一种常见的神经系统退行性疾病，临床上主要表现为静止振颤、运动迟缓、肌肉僵直和姿势不稳定等运动症状(1,2)。引起这些症状的原因是中脑黑质多巴胺神经元大量死亡和由此引起的纹状体部位的多巴胺神经递质的大幅度减少。帕金森病的主要病理特征是神经细胞内出现嗜酸性包涵体——路易体(Lewy body)和路易神经索(Lewy neurite)。构成路易体和路易神经索的主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein)(3)。其中，约90％的α-突触核蛋白为磷酸化修饰形式(4)。大量研究表明，磷酸化修饰可促进α-突触核蛋白的聚合，从而在帕金森病的发生和发展中起关键性作用(5-9)。因此，检测磷酸化α-突触核蛋白在体液中的变化被认为对帕金森病具有诊断意义。目前研究表明，帕金森病人血液中磷酸化α-突触核蛋白含量增高，而总α-突触核蛋白及寡聚化α-突触核蛋白则无此改变(7,10)。因此，磷酸化α-突触核蛋白可能成为一种帕金森病诊断的潜在标记物。然而，由于检测技术的限制，血液中磷酸化α-突触核蛋白检测的灵敏度及特异度较低。 

现有技术中对血液中磷酸化α-突触核蛋白检测方法主要有：利用ELISA方法直接检测其含量。 

现有方法的缺陷是：患者和对照的差异较小，很多数据重叠，难以用于临床。本方法的优势：数据稳定，患者和对照差异较大；主要反映血浆促进α-突触核蛋白磷酸化的能力。 

为克服上述缺陷，本发明提供一种检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白形成的方法，该方法具有较好的稳定性和重复性，可以显著区分帕金森病人和正常健康人，是帕金森病高危人群筛选、临床诊断及病情监测的重要手 段。 

发明内容：

本发明提供一种帕金森病的诊断方法，其中包括检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白如α-突触核蛋白形成能力的方法。 

本发明将纯化的重组人疾病相关蛋白与受试者体液在一定温度下进行振荡孵育，然后利用鼠抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，利用生物素化的鼠抗人α-突触核蛋白单克隆抗体作为检测抗体，利用抗原-抗体反应原理检测帕金森病人和正常健康人体液体外促进疾病相关蛋白磷酸化修饰形式的形成能力并进行比较。 

本发明检测受试者体液体外促进磷酸化修饰的疾病相关蛋白如检测α-突触核蛋白形成能力的方法包括以下步骤和内容： 

1)分离血浆； 

2)加入重组人α-突触核蛋白，得到磷酸化α-突触核蛋白； 

3)抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体和磷酸化α-突触核蛋白以及抗人α-突触核蛋白单克隆抗体孵育，随后加入碱性磷酸酶和显色剂，进行显色； 

4)用分光光度法对显色的样品进行吸光度测定，根据标准曲线计算样品中磷酸化α-突触核蛋白的含量。 

以下对本发明所用名称术语进行解释： 

重组人α-突触核蛋白：将携带人α-突触核蛋白基因的质粒转染至大肠杆菌，培养、提取并纯化获得的帕金森病相关蛋白。 

磷酸化α-突触核蛋白：129位丝氨酸发生磷酸化修饰的α-突触核蛋白。 

抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体：抗原为含129位磷酸化修饰的丝氨酸在内的人α-突触核蛋白短肽，其氨基酸序列为GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA，与灵长类动物发生反应。本发明使用的抗人磷酸化-α-突触核蛋白单克隆抗体名称为：4E6抗体，为已知抗体，是Santa cruz公司所售的p-α-synuclein(Ser129)抗体(货号：sc-135638)。 

抗人α-突触核蛋白单克隆抗体：3D5抗体，识别α-突触核蛋白第115-121个氨基酸，抗原为人重组α-突触核蛋白，与灵长类动物发生反应。(该抗体已经公开，在S.Yu,et al.Neuroscience,145(2007)539-555中已经发表，可通过购买得 到)。也可以按照以下方法制备： 

步骤1，蛋白抗原的制备：本实验室制备并纯化人全长α-突触核蛋白作为抗原。 

步骤2，免疫小鼠；使用福氏完全佐剂(第一次免疫)与福氏不完全佐剂(随后的免疫)乳化人α-突触核蛋白，每隔2周对BALB/c雌性小鼠进行免疫(50mg抗原/只小鼠)。抽取动物血清，利用ELISA与Western blot方法检测其效价与特异性。