[发明专利]甲胎蛋白检测试剂盒及其制备

说明书

技术领域

本申请涉及一种基于胶体金免疫比浊法的甲胎蛋白检测试剂盒及其制备。

背景技术

早在1944年已有人对甲胎蛋白的存在进行过研究，但直到1965年美国科学家Bergstyandh和Czar才观察到2例原发性肝癌患者血清能与抗胎儿血清的单价抗血清起反应，说明原发性肝癌患者血清中与人类胎儿血清中有一共同的特殊成分，并将这种特殊的蛋白成分称为甲种胎儿球蛋白(α-fetoprotein，AFP)。此后的研究发现这种蛋白在18种哺乳类动物之间有交叉反应。长期以来，人们只是把AFP作为一个肿瘤标志物，用于原发性肝癌(HCC)的诊断指标之一。

由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及，已经发展出来多种快速免疫比浊检测技术。

乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是，首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。然而，乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，干扰试验结果，且乳胶制造成本较高，导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法，如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合，以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了，表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。

本发明研究表明，许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求，比如：氧化铁等磁性纳米颗粒在40nm以上时由于顺磁性和比重等因素而容易聚沉无法达到应有的稳定性；金纳米颗粒在粒径80-150nm的范围内稳定性太差而不合适等。根据中国专利CN102749454的教导，本发明以直径为35nm-60nm的胶体金颗粒进行试验，发现，灵敏度较差，无法满足临床中对灵敏度小于1ng/mL的要求，和最低检测限5ng/mL的要求，且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间，因此常常造成假阴性的结果；同时还存在反应时间长(平衡时间5-10min)，无法达到快速检验的要求。

发明内容

为了克服现有技术存在的错误教导，解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种基于胶体金免疫比浊法的甲胎蛋白检测试剂盒。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高，制造成本低，反应后不产生沉淀，方便生化仪清洗。

根据本发明的一方面，提供一种基于胶体金免疫比浊法的甲胎蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了甲胎蛋白抗体的金纳米颗粒的溶液，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，优选67.2nm-72.4nm；所述金纳米颗粒和抗体质量比在50：20–60，优选50：40-60。

具体来讲，所述试剂R2为PH值5.0-9.5，优选6.0-8.5的溶液。

进一步地，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，促凝剂为重量体积比0.4％以内的PEG20000，稳定剂为重量体积比2％以内的BSA，蔗糖的重量体积比为20％以下，甘油的重量体积比为20％以下。

作为优选，上述R2为含有粒径为72.4±1.5nm且标记了甲胎蛋白的金纳米颗粒、重量体积比20％蔗糖、重量体积比0.2％PEG20000、重量体积比0.5％BSA和重量体积比5％甘油的，pH7.2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗粒和抗体的重量比为50：40-60。

更进一步地，所述基于胶体金免疫比浊法的甲胎蛋白检测试剂盒还包括起缓冲和稳定作用的试剂R1，所述试剂R1为含有重量体积比0.2％BSA、重量体积比0.1％的NaN3和重量体积比0.05％Tween20的，pH7.2的磷酸盐缓冲液。在本发明的试剂盒中，发明点主要在试剂R2，试剂R1也可以使用现有免疫比浊法中检测试剂盒的试剂R1。

上述试剂R2通过如下方法制备：

制备金纳米颗粒；

将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液；

偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂；

2800rpm离心2小时；