[发明专利]一种固定化脂肪酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化脂肪酶的制备方法。 

背景技术

脂肪酶是一类应用广泛的酰基水解酶，它能催化酯类的水解、醇解、合成和交换等反应，现已广泛应用于制药、化工、食品加工、污水处理等行业。与传统工业催化剂相比，脂肪酶也存在许多缺陷，如：提取纯化过程繁琐，价格昂贵；对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不稳定；在反应中易失活，反应后不能被回收再利用；脂肪酶中常含有杂蛋白及有色物质，影响反应产物的分离纯化。为了克服脂肪酶的上述不足，人们将游离脂肪酶与不溶性载体联结起来，使之成为固定化脂肪酶，实现了脂肪酶的回收再利用。因此，脂肪酶催化技术的工业化很大程度上取决于脂肪酶的固定化技术的发展。

Fe₃O₄纳米粒子是一种重要的磁性分离材料，它具有特殊的磁响应性，可借助外磁场从反应体系中快速简便地富集、分离、回收固定化生物酶，甚至能利用外部磁场控制Fe₃O₄纳米粒子的运动方式和方向，避免传统的搅拌对酶蛋白结构的机械损伤，有利于提高酶制剂的稳定性，在生物工程领域具有极大的应用价值。尽管已有磁性Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂、Fe₃O₄@chitosan纳米粒子固定脂肪酶的文献报道（Chem. Asian J., 2013, 8, 1447-1454；J. Mater. Chem., 2012, 22, 8385-8393；Catal. Commun., 2011, 12, 717-720.），但目前文献报道磁性纳米粒子固定脂肪酶的脂肪酶在固定化过程中损失部分催化活性，导致固定化脂肪酶酶活的回收率小于100%，且其固定化制备过程不温和，不能满足工业化生产需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用氨基官能化的磁性Fe₃O₄@C纳米粒子为载体固定脂肪酶的方法，该方法简单、温和，脂肪酶的固载量多，且固定化脂肪酶酶活高和酶活回收率高、稳定性好、可简便地循环再使用。

本发明固定化脂肪酶的制备方法，使用氨基官能化的磁性Fe₃O₄@C纳米粒子作为载体，通过共价结合将脂肪酶固定在其表面。

上述方法包括2种具体的实现方式。

方式一：先利用亲核反应将戊二醛一端的醛基与氨基官能化的磁性Fe₃O₄@C纳米粒子表面的氨基相结合后，再将固定在磁性Fe₃O₄@C纳米粒子表面的戊二醛另一端的醛基与脂肪酶的氨基相结合。

具体包括以下步骤：

1）将氨基官能化的磁性Fe₃O₄@C纳米粒子加入到戊二醛溶液中，于25~45 ℃条件下反应3~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；

2）将步骤1）所得的产品加入到脂肪酶溶液中，于25~35 ℃条件下反应0.5~3 h，所得产品经磁分离、洗涤即可。

所述的氨基官能化的磁性Fe₃O₄@C纳米粒子与戊二醛质量比为1:1~5；所述的氨基官能化磁性Fe₃O₄@C纳米粒子与脂肪酶的质量比为1:0.1~0.5。

所述的戊二醛溶液的浓度为10-100 g/L。

方式二：利用羧化试剂将磁性Fe₃O₄@C纳米粒子表面的氨基转化为羧基，再经活化剂的作用后，利用酰胺化反应在Fe₃O₄@C纳米粒子表面固定脂肪酶，所述的羧化剂为丁二酸酐，所述的活化剂为物质的量比为1:0.5~2的N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺混合物。 

具体包括以下步骤:

1）将丁二酸酐溶于甲苯内，再加入氨基官能化的磁性Fe₃O₄@C纳米粒子，在氮气气氛中于70~100 ℃条件下反应4~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；

2）将N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺溶于二氯甲烷内，将步骤1）所得的产品加入到其中，于25~50 ℃条件下反应2~24 h，所得产品经磁分离、洗涤、真空干燥；