[发明专利]猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及是一种用于检测猪圆环病毒2型的荧光PCR试剂盒及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus ,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属的成员，根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列可将其分为PCV1和PCV2两个基因型。PCV1广泛存在于猪源肾细胞中，人们广泛认为PCV1不具有感染性；而PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎-肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、母猪流产与繁殖障碍等密切相关, 常发生混合感染造成猪的免疫失败。目前，该病在世界各主要养猪国家均有发生，给养猪业造成了十分严重的经济损失。迄今，国内外学者已经建立了病毒分离鉴定、PCR、间接免疫荧光（IFA）、免疫组化（IHA）等多种方法用于PCV2的检测，但以上方法都不能对PCV2 进行定量检测。实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR)是近几年发展起来的一种新的核酸检测技术，该技术可实现对病毒的实时定量检测，己在人类和畜禽传染病的诊断中得到越来越广泛的应用。

本专利依据荧光定量PCR技术的原理，针对猪圆环病毒2型CAP基因保守序列，通过各种条件的优化和筛选，设计出１组引物，可用于样品中猪圆环病毒2型的检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测猪圆环病毒2型的特异性引物组，其特征在于：

PCV2-F gggctccagtgctgttattc  SEQ ID NO：1

PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa  SEQ ID NO：2 

（1）它是针对猪圆环病毒2型CAP基因的保守区域设计的。

（2）可检测出猪圆环病毒2型。

本发明的另一个目的是提供含有上述引物组的试剂盒。所述的试剂盒包括：

（1）荧光PCR反应液：

每个反应液中含有：Platinum? SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG with ROX  (2×)12.5 μL，

PCV2-F引物(10 μmol/L )1μL，PCV2-R 引物(10 μmol/L)1μ L。

（2）用于试剂盒的引物为：

PCV2-F gggctccagtgctgttattc  SEQ ID NO：1

PCV2-R tagcgggagtggtaggagaa  SEQ ID NO：2 

（3）阳性对照标准品：含有圆环病毒2型CAP基因的克隆质粒PMD-18T-CAP,质粒的最终浓度为1×10¹⁰拷贝/μL；

（4）阴性对照标准品：猪圆环病毒2型阴性猪的组织DNA，通过PCR检测为阴性的样本。

本发明所述用于检测猪圆环病毒2型SYBR Green荧光PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤：

（1）待检样品的DNA提取

（2）荧光PCR检测：根据待检样品的数量将荧光定量PCR反应液分装到PCR管中，每管12.5μL；PCR管中加入样品DNA模板3~5μL，加水补充至25μL体系；并设立阳性对照、阴性对照和空白对照的荧光PCR检测。

（3） 扩增反应过程：PCR管放入荧光PCR仪，扩增程序为95℃预变性 3min；95℃变性 10s，63℃退火/延伸30s，共40个循环。

（4）结果判定：动力学曲线呈指数扩增，Ct值≤34，且阴性和空白对照无扩增，阳性对照成立，检测样品的Tm值在81℃至82℃之间，判定为猪圆环病毒2型阳性。

本试剂盒的荧光PCR优化过程：

（1） 引物浓度的优化  将引物PCV2-R，PCV2-F稀释至浓度均为 10μmol/L，分别取0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL的上下游引物，以标准品质粒为模板，采用矩阵法，进行荧光 PCR扩增，结果表明：当PCV2-F和PCV2-R均为1μl时，对质粒标准品的检测可获得较小的Ct值和较大的△Rn值。

（2） 循环条件的优化  为了获得荧光PCR引物的最佳工作条件，使用筛选的最佳引物工作浓度，分别按照以下程序进行PCR反应，每个样品作3个平行重复，同时以无菌三蒸水作空白对照。