[发明专利]一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用。

背景技术

地龙，即蚯蚓，性寒，味微咸，是我国传统的中药材。据记载，两千多年前，我们祖先就是应用地龙治疗气虚血滞，脉络淤阻所致中风、半身不遂等疾病，《本草纲目》中列出了40多种地龙药方。现代药理研究发现，它不但抗凝、抑制血小板聚集、抗心律失常，而且还有抗癌和镇痛的作用。这些功效成分多以水煎提取或打粉直接口服，前者的利用率低，后者的服用剂量大，且进入人体后带来的活性不高。有人从地龙中提取单一的蛋白制成制剂，但制成的口服制剂经过胃肠道，容易被胃酶、胰酶酶解掉，活性大大降低；而制成注射液，大分子蛋白类又容易引起免疫原性，存在安全隐患。这两种方法得到的功效物质非常复杂，分子量多在12000至80000范围，在一定程度上影响了其临床应用和药效研究跟踪。

市面上已有地龙冻干粉辅以其它中药材用以治疗心脑血管病，还尚未出现将地龙蛋白酶解得到的活性小肽用以制成抗凝血溶栓的功能性产品，因此开发出一种低成本、高活性的地龙产品具有广阔的市场经济效益。

本发明采用可控酶解的方法，通过两步生物蛋白酶对地龙蛋白进行水解催化作用，把其中隐藏的抗凝血活性肽片段释放出来，从而制备具有抗凝血溶血栓活性的多肽。目前，对于生物活性肽的开发在国内外已成为热点研究领域，多肽高活性、快吸收、安全健康的特点广受产品开发者的青睐，已从可食蛋白中水解分离得到的有高F值寡肽、抗氧化肽、ACE抑制肽等，且多肽的开发所需仪器设备、生产条件简单可行，所以，酶解地龙蛋白制备抗凝血活性肽具有很高的可行性和广阔的市场经济效应。

经查阅已有专利，申请号为“201110375207.3”的专利，其权利要求为一种抗血栓作用的地龙提取物，将广地龙饮片粉粹，加5～15倍水浸泡4～5h，连同浸泡液入粉碎机湿法粉碎至D50≤100μL浆料，上清液过0.45μm的陶瓷膜，滤液冷冻干燥，得粉状地龙提取物。此专利中的发明主要浸泡、粉碎和过滤的方法得到地龙粗提取。本专利采用双酶(碱性蛋白酶和胰蛋白酶)分步酶解得到抗凝血活性粗多肽，再用DEAE sepharose FF阴离子交换柱和DA201-C大孔吸附树脂交换柱进行分离纯化，采用ATPP、PT、TT、FIB四项指标和体外溶栓法对多肽的抗凝血活性进行比较，得到具有较高抗凝血溶栓活性的多肽，与上述专利得到的物质不同。

申请号为“200910033500.4”的专利，为一种红地龙精制蛋白多肽制剂的制备，将红地龙加水匀浆，取上清液，经过十万、五万、一万的超滤膜过滤，并将五万孔径截留液和药学上可接受的载体制备得到红地龙精制蛋白多肽制剂。此专利主要采用超滤膜截留得到十万以下五万以上的一类具有溶血栓功能的红地龙蛋白质。本专利采用双酶(碱性蛋白酶和胰蛋白酶)分步酶解得到抗凝血活性粗多肽，再用DEAE sepharose FF阴离子交换柱和DA201-C大孔吸附树脂交换柱进行分离纯化，得到具有较高抗凝血溶栓活性的多肽，与上述专利得到的物质不同，故并不影响本专利的申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用。本发明方法能够实现原料的高效利用，具有高活性、高安全、简单可控、环境温和的制备特点。

本发明的目的由以下方案实现：

(1)取地龙洗净干燥，粉碎成细粉；加水溶解，溶解比例为20～40g：100mL，pH调至8.5～11.5，以转速200～400r/min搅拌1h～5h以加速溶解，取上清液调pH至3～5.5，干燥，制得地龙蛋白；

(2)将步骤(1)得到的地龙蛋白加水溶解，比例为20～40g：100mL，控制pH值在7.5～11.5，再加入碱性蛋白酶为生物催化剂，反应温度为40～80℃，以100～300r/min匀速搅拌1～3h；煮沸5～30min，灭酶活；再将pH调至7.0～10.0，加入胰蛋白酶，温度25～60℃，搅拌速度100～300r/min，时间1～3h，煮沸10min，结束反应，5000～10000r/min离心，收集上清液，浓缩干燥，得到多肽粉。