[发明专利]一种基于酿酒酵母孢子的微胶囊固定化酶的制备方法

权利要求书

1.一种微胶囊固定化酶的制备方法，其特征在于，构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶是α-半乳糖苷酶，编码所述α-半乳糖苷酶及其自身信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酶在信号肽的引导下表达在周质间隙。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶是蔗糖酶或植酸酶。

5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒pRS424-TEFpr，得到重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1；

(2)将得到的重组质粒pRS424-TEF_pr-MEL1转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母；

(3)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp培养基中，28℃～32℃培养，过夜；

(4)将步骤(3)中的菌液转接到YPAce培养基中，28℃～32℃摇床12h～16h；

(5)离心收集步骤(4)中的菌体，清洗，然后用1.5％～3％醋酸钾重悬，28℃～32℃摇床24h～48h，使酿酒酵母在胞内形成孢子；

(6)收集、破碎重组酿酒酵母细胞，收集、纯化获得在孢子壳聚糖层和二酪氨酸层之间表达了α-半乳糖苷酶的孢子。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)收集重组酿酒酵母细胞，用PBS溶液洗2～3次，然后再用PBS溶液重悬；向细胞悬浮液加入Lyticase，冰上超声；用PBS溶液将破碎细胞洗2～3次，弃去上清得到重组酿酒酵母孢子。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，将收集得到的重组酿酒酵母孢子用Triton X-100溶液洗涤，然后将孢子悬浮在Triton X-100溶液中；利用Percoll分层液，离心获得纯的孢子，用PBS溶液洗涤孢子2～3次，冷冻干燥。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述SD-Trp培养基成分为无氨基酸酵母氮源、去离子水，灭菌后，补加单独灭菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合物。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述YPAce培养基成分为酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸钾。