[发明专利]一种用于微卫星标记多态性检测的聚丙烯酰胺凝胶溶液及银染方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种SSR检测过程中所用的凝胶试剂及其使用方法，属于生物技术领域。 

背景技术

微卫星(SSR)，又称简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSR)，由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。 

在SSR多态性检测方法中，PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)是一种广泛应用的方法，采用银染方法对聚丙烯酰胺凝胶电泳进行染色。 

银染方法的基本原理是先用固定液将核酸固定到凝胶上，然后使银染剂中的银离子与之牢固结合，再通过还原剂将银离子还原，从而发生了显色反应，使得目标产物可见。银染法对试剂的要求不高，并且固定液和染色液可以重复使用，降低了试验成本，所用试剂安全稳定，对操作者的健康所造成的危害性甚微，银染后的凝胶可以长期保存，更有利于对试验结果的回顾性分析，因此基于PAGE的银染方法在生物技术领域得到了广泛应用。 

聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel，PAG)是由丙烯酰胺单体(Acrylamide，简称Acr)和交联剂N1，N1-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构的凝胶。PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的凝胶浓度决定。凝胶浓度能够在3％～30％中变化。在微卫星标记开发和检测过程中，一般选择Acr/Bis：20-40的浓度。该浓度下，PAG完全透明且有弹性，但在显色过程中，PAG胶易碎裂，在拍照时需要进行“拼图”，在数据分析时，碎裂后拼接的PAG会增大结果的误差；同时，已有的检测方法用于SSR还存在PAG在显色后颜色深，条带不易区分 等问题。 

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种用于微卫星标记多态性检测的聚丙烯酰胺凝胶溶液以及相应的银染方法，采用本发明的凝胶进行银染显色，PAG在振荡显色过程中，破损较少，避免了PAG拼接，减少了实验误差，保证了结果的准确性。 

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的： 

一种用于微卫星标记多态性检测的聚丙烯酰胺凝胶溶液，包括聚丙烯酰胺凝胶母液、5×TBE、10％APS(过硫酸铵)、TEMED(四甲基乙二胺)，用蒸馏水稀释至聚丙烯酰胺凝胶母液体积占总体积的21-22％，其中5×TBE用量与聚丙烯酰胺凝胶母液相同。 

在上述中，各成分含量均以体积比计算。 

在本发明中，所述聚丙烯酰胺凝胶母液浓度为20-40％，优选聚丙烯酰胺凝胶母液浓度为30％。 

上述所用的PAG母液与常见的PAG母液组成相同，将丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺按照一定比例(通常是20-30：1)用双蒸水定容至所需浓度。例如30％聚丙烯酰胺凝胶母液的配制方法为580g丙烯酰胺，20g甲叉双丙烯酰胺，双蒸水定容至2L，37℃恒温过夜保存即可。 

在本发明中，10％APS(质量体积浓度)、TEMED采用现有技术中的常规用量，通常是10％APS用量(体积)占凝胶溶液总体积的0.85-0.95％，TEMED用量是10％APS(体积)的1/10。 

其中，5×TBE可采用市售的此类缓冲液，组成为本领域技术人员广泛所知，典型的组成是采用Tris碱54g，硼酸27.5g，Na2EDTA.2H2O4.65g，溶于750ml双蒸水，再加双蒸水定容至1000ml，目前市售制剂大多采用该组成。 

在上述基础上，本发明还公开了用于微卫星标记多态性检测的聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染方法，在电泳结束后，用PAG染色液浸泡权利要求1所述的聚丙烯酰胺凝胶10-30min，然后用PAG显色液显色5-10min，最后用终止液终止2-3min；其中PAG显色液中甲醛的含量为0.2％。 

在上述方法中，通过特定用量的甲醛作为还原剂，有效加速与蛋白质结合的 Ag+的还原，基于本发明的聚丙烯酰胺凝胶溶液，甲醛用量显著低于传统方法，用于PAG显色时，颜色浅，条带清晰，检测准确度更高。