[发明专利]一种MPK细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种培养基的配制和使用方法，更具体的，涉及一种用于大规模高密度培养MPK细胞制备猪瘟疫苗的培养基。 

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，它具有高度的传染性和致死性，给养猪业造成了严重的经济损失。目前，接种猪瘟疫苗是控制猪瘟的重要手段。用于制备猪瘟疫苗的细胞主要有ST细胞、PK-15细胞及SK-6细胞等，采用MPK细胞(Minipig Kidney Cell)培养猪瘟病毒的专利及文献鲜有报道。 

猪瘟疫苗的生产工艺目前主要是转瓶培养，进行大规模生产时：(1)需要大量的人力物力，生产效率较低，生产成本较高；(2)转瓶内的培养条件无法做到及时调整，无法确保细胞处在最佳生长状态，获得的细胞密度及猪瘟病毒滴度较低；(3)转瓶中的细胞碎片及杂蛋白多，导致各批次疫苗产品的均一性较差，质量不稳定。 

另外，采用生物反应器的微载体培养细胞制备猪瘟疫苗的研究越来越多，其生长及维持培养基中通常需要加入10％-20％的动物血清，以提供细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支持蛋白。但是，动物血清也有其明显的缺点：成分不明确，产品批间差异不易控制，价格昂贵，并且要求极其严格的检测程序以确保血清中不含有血清来源动物可能携带的细菌、病毒等。 

生物反应器及多种适合的载体己被广泛应用于动物细胞培养，其优点在于，许多种类的生物反应器可以通过灌流培养的方式实现大规模高密度培养动物细胞。为达到良好的培养效果，生物反应器的参数设置和所选培养基的成分是其中的重要因素。目前，针对生物反应器大规模高密度培养MPK细胞制备猪瘟疫苗的培养基的研究尚未见报道。 

发明内容

本发明提供了一种适用于大规模高密度培养MPK细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其使用方法。使用本发明所述的培养基，使MPK细胞的大规模高密度培养在低血清浓度条件下进行。接种猪瘟病毒后，使用本发明所述的无血清、低蛋白的培养基用来维持病毒在培养液中的增殖。本发明提供的培养基及其使用方法，使MPK细胞可高效的贴附在微载体上，细胞生长速度快，细胞形态好，在灌流培养方式下可以在3-7d内达到极高密度；接种猪瘟病毒后，在维持培养基培养下，可以连续收获病毒液12-17d。 

本发明所述的一种大规模高密度培养MPK细胞制备猪瘟疫苗的培养基，其组成成分及重量份为： 

上述培养基的组成成分及重量份优选为： 

上述培养基，在使用前加入2％-5％的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成在大规模高密度培养MPK细胞的培养液。 

本发明的一种大规模高密度培养得到MPK细胞接入猪瘟病毒后，维持病毒感染时期的培养基，其组成成分及重量份为： 

上述培养基的组成成分及重量份优选为： 

上述培养基还包含如下成分及其重量比例： 

上述培养基包含的添加成分，其重量份的优选比例为： 

所述大规模高密度培养MPK细胞所用的生物反应器可使用本领域常用的内部结构支持使用载体 的各类生物反应器，例如德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Sartorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器生物反应器，杭州安普公司生物反应器，上海日泰公司生物反应器，广州齐志公司生物反应器。优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Sartorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器，更优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器。 

所述载体可选自常规使用的各种材料制的载体，包括化工材料的聚丙烯，PLA，PGA，多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，胶原蛋白，琼脂，谷物蛋白等。优选使用葡聚糖材料的微载体，更优选使用美国GE公司Cytodexl球形微载体。