[发明专利]一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测肟基乙酸酯类杀菌剂的人工抗原合成及ELISA检测方法。

背景技术

肟基乙酸酯类杀菌剂属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的一类，杀菌谱广，安全高效。虽然这类农药毒性低，但因用量逐年增加，仍旧存在安全风险。因此国内外仍然对其在食品中的残留进行了监控并制定了严格的限量标准，造成我国农产品出口壁垒，影响我国的出口经济形势。

当前，该类杀菌剂常用的气相、液相等仪器检测方法灵敏度高、准确性好、检查范围广，且已有较为成熟的检测标准，但是所需仪器昂贵、样品前处理时间较长，不适于现场监测。

免疫检测方法(immunoassay，IA)也具有灵敏度高、特异性强的特点，并且可以克服繁杂的前处理步骤，广泛运用于现场检测，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，在食品安全检测中发挥着越来越重要的作用。

因此有必要开发一种免疫技术用于检测肟基乙酸酯类的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。本发明主要选取醚菌酯和肟菌酯为代表，进行ELISA方法的建立。

肟基乙酸酯类杀菌剂的毒杀基为甲氧亚胺基乙酸甲酯，而(E)-2-(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亚氨基乙酸甲酯(OEBr)是一种常见的农药中间体(图1，分子量＜1000)，结构中包含肟基乙酸酯类杀菌剂的活性官能团，因此将其作为半抗原合成原料之一与巯基丙酸(图2)合成肟基乙酸酯类杀菌剂的人工半抗原(AR)。该半抗原仍是一种小分子物质，没有免疫原性，须与大分子载体(蛋白)等偶联得到人工抗原后，才可以作为动物免疫原料，制备多克隆抗体。

本发明根据以合成的与肟基乙酸酯类杀菌剂的化学结构类似的人工半抗原(OESCH2CH2COOH)与牛血清蛋白和卵清蛋白进行偶联，分别制得免疫原和包被原。

发明内容

本发明需要解决的第一个技术问题在于提供一种肟基乙酸酯类杀菌剂的人工抗原的合成方法及测定方法。

1.技术方案

(1)人工半抗原合成

在50mL三口瓶中，加入5mL1equiv的巯基丙酸乙醇溶液，然后加入2equiv的NaOH，放在有加热功能的磁力搅拌器中搅拌反应，直至溶解。加入1equiv的OEBr乙醇溶液，加热回流反应1.5h后抽滤得到透明溶液，旋转蒸发除去有机溶剂。然后用5mL5％NaHCO₃溶液溶解残留物并转移到分液漏斗中，用正已烷萃取2次，每次5mL，弃去有机相。然后用浓盐酸调水相pH至3左右，和二氯甲烷进行液液分配，反复3次，收集有机相。有机相过无水Na₂SO₄，减压浓缩近干，得黄色油状物。

(2)人工抗原的合成

a.免疫原(活化酯法)：将半抗原0.1mmol和NHS0.1mmol用1.0mLDMF溶解。磁力搅拌下，向上述溶液中逐滴加入1.0mL的0.1mmolDCC的DMF溶液，室温搅拌反应1h，4℃冰箱中搅拌过夜。次日，离心取上清液，在搅拌状态下，将上清液逐滴加入到6.0mL，60mgBSA的pH8.0硼酸缓冲液中，约半小时加完，室温磁力搅拌反应1h，4℃搅拌反应过夜，次日取出，溶液转入透析袋中，悬于大烧杯中，4℃，pH7.4的PBS缓冲液透析3天，每4h换水一次。冻干保存。

b.包被原(混合酸酐法)：称取150mgOVA溶于10mL的硼酸缓冲液中，80μmol的半抗原溶解在1mL的DMF中，然后在该溶液中加入等当量的三正丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应1h，反应液500μL加入到8mL的15mg/mL的OVA硼酸缓冲液中，磁力搅拌，反应2h。反应完成后，转入透析袋，先用蒸馏水透析1次，再换pH7.4的PBS透析，整个透析过程持续三天，每4小时换透析液一次。冻干保存。

(3)本发明同时对所制备的人工半抗原及抗原的鉴定方法进行了公开说明，方法包括TNBS显色法、红外光谱法、紫外光谱法、SDS-PAGE，具体包括下列步骤：

1)人工半抗原的鉴定：称取合成的半抗原的样品，适当稀释成合适的检测浓度，进行TLC(图3)、紫外(图4)、红外图谱扫描(图5)、质谱(图6)和核磁(图7)。读取半抗原的波峰与波谷的位置并分析半抗原的官能团的红外吸收情况、分子量及各官能团的原子组成。

2)人工免疫原和包被原的鉴定：将BSA用蒸馏水配制成浓度为0、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的溶液，取1mL加入到1mLpH10的碳酸盐缓比色。根据吸光值和蛋白质浓度作出标准曲线。斜率即BSA单位浓度的吸光值。