[发明专利]鼠李糖诱导型启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及启动子，尤其涉及一种从毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分离鉴定的鼠李糖诱导型启动子，本发明还涉及含有该鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及重组宿主细胞，本发明进一步涉及该诱导型启动子在调控外源基因在真核细胞中进行适时、适量表达等方面的应用，属于鼠李糖诱导型启动子的分离及应用领域。

背景技术

毕赤酵母表达系统以高密度发酵、发酵工艺成熟、发酵成本低、产物易分离等优点而广泛用于外源蛋白的表达(Macauley-Patrick等人，2005，Yeast，22:249-270；Damasceno等人，2012，Applied Microbiology and Biotechnology，93:31-39)。毕赤酵母利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源时，甲醇诱导表达甲醇代谢所需的酶类如醇氧化酶(Alcohol Oxidase,AOX)的含量可达到胞内蛋白的30％(韩雪清等人，2003，微生物学杂志，23：35-40)，因此AOX1启动子(P_AOX1)是一个适用于外源基因高效表达的调控因子，基于P_AOX1的毕赤酵母表达载体得以广泛应用。但使用这类表达系统时会存在以下两方面问题：1)在实验室小规模发酵时，涉及到繁琐的培养基置换的过程；2)在诱导表达蛋白特别是在大规模发酵时，涉及大量甲醇存放、使用等过程，因而存在较大的风险。另外，基于毕赤酵母组成型强启动子—三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(P_GAP)的表达载体也得以广泛应用，但这类表达系统也存在以下弊端：1)在组成型启动子的调控下，目的蛋白在整个发酵期间持续表达，因此难以实现外源蛋白表达的精确控制；2)当所表达的蛋白对宿主细胞的生长有副作用时，难以实现目的蛋白的表达。

研究表明，鼠李糖可诱导与鼠李糖代谢相关酶类的表达，并且多个鼠李糖诱导型启动子被分离并应用于外源基因的表达(Cardona等人，2006，Appl Environ Microbiol，72：2547-2555；Fieseler等人，2012，PLoSOne，7；Wegerer等人，2008，BMC Biotechnol，14)。真核生物中，鼠李糖代谢的初始步骤中主要涉及如下四种酶：L-鼠李糖脱氢酶(L-rhamnose1-dehydrogenase)、内酯酶(lactonase)、脱水酶(dehydratase)、醛缩酶(aldolase)。研究表明，木糖发酵酵母(Scheffersomyces stipitis)中与鼠李糖代谢相关酶基因形成基因簇，并且相关基因表达受鼠李糖特异性诱导(Koivistoinen等人，2012，Gene，492:177-185)。毕赤酵母亦可利用鼠李糖为唯一碳源和能源，然而在毕赤酵母GS115染色体上仅有PAS_chr1-4_0075位点被注释为L-鼠李糖脱水酶编码基因，其它三个基因未被确定。

因此，从毕赤酵母GS115染色体上鉴定分离一种鼠李糖诱导型启动子进而构建基于该鼠李糖诱导型启动子的真核表达载体，不仅可避免使用危险物甲醇，还可通过控制诱导物的添加量和添加时间来调控目的蛋白适时、适量地表达，在外源基因适度表达和基础研究方面也将具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种从毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分离的鼠李糖诱导型启动子。

本发明的目的之二是提供一种含有上述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及含有该表达载体的重组宿主细胞。

本发明的目的之三是将所述的鼠李糖诱导型启动子以及含有该鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体应用于外源基因适度表达和基础研究等方面。

本发明首先提供了一种从毕赤酵母GS115中分离鉴定的鼠李糖诱导型启动子，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：

(a)、SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有鼠李糖诱导型启动子的功能；或