[发明专利]一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法

说明书

【技术领域】：本发明涉及生物材料、组织工程和高分子材料领域，具体涉及一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法。

【背景技术】：生物医学组织工程是一个涉及细胞生物学、材料科学、反应器工程和临床医学的多学科交叉研究领域。其目的在于构建新的组织和器官。最初认为，所谓组织工程就是将细胞置于适合的反应器条件下进行三维培养，使其构建成为组织，并进而发展成为人体器官的替代物。组织工程的三要素就是支架材料、种子细胞和生长因子。

用于组织工程的支架材料必须具有良好的生物相容性；良好的细胞亲和性；合适的生物降解性和降解速率；可负载生长因子及传递生物信号等特点。目前可用于组织工程的支架材料有：无机材料，羟基磷灰石、磷酸钙；天然高分子材料，壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、丝胶、聚谷氨酸；合成材料，聚乳酸、聚己内酯等。

水凝胶是一类引起组织工程领域极大关注的生物材料。因为水凝胶具有高度的生物相容性以及可与软组织媲美的机械特性。水凝胶是以水为分散介质的凝胶，在具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀形成交联聚合物。

聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有温度敏感性，其LCST约为32℃。Okano等根据PNIPAAm的疏-亲水性间可逆变化的特性，将PNIPAAm以共价键形式固定在聚苯乙烯板(TCPS)表面进行细胞培养。37℃时细胞在TCPS表面粘附增殖，当温度由37℃降至32℃时，TCPS由疏水性转化为亲水性，即接枝有PNIPAAm的TCPS吸水膨胀，整体细胞群则在保持细胞间连接状态下以片状的形态得以脱附，这种方法经济、方便，可以更好地保持细胞的分化特性及细胞的完整性。然而此类凝胶存在机械性能差、易碎、生物相容性差等缺点，不利于在组织工程等领域应用。

γ-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键的方式缩合而成的一种多肽型高分子。γ-PGA具有良好的生物相容性和生物降解性，可单独使用或者与传统的组织工程材料结合用于组织修复，引入γ-PGA可改善材料的细胞亲和性，更有利于细胞的粘附和增殖；也可用于药物载体提供药物缓释性和靶向性。

干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度的自我复制能力、高度增殖和多向分化性能，可分化成多种功能细胞及组织器官，在治疗各种细胞损伤性疾病等方面拥有极强的优越性。胚胎干细胞(ES)/诱导多能干细胞(iPS)比其它干细胞更为原始，其扩增能力更强，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。但是胚胎干细胞面临着伦理道德和法律问题，使得iPS细胞的出现，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响。

细胞生长因子在促进干细胞自我更新和定向分化的过程中扮演着重要的角色，但是生长因子都是分子量不大的可溶性多肽，对于微环境中的pH值变化、有机溶剂、超声波及酶等都非常敏感，易于变性或降解，而且生长因子的半衰期较短，如果采用传统的将生长因子加入细胞培养液的方式，其诱导作用将很快失效；同时，过量的生长因子加入会导致细胞的癌变。因此，细胞支架材料设计必须能够稳定生长因子的活性并达到对其控制释放的目的。肝素和硫酸化蛋白多糖等通过静电相互作用来保持生长因子在体内的稳定性。据报道肝素、硫酸化蛋白多糖和合成的类肝素都具有保护生长因子活性的作用，因为当硫酸化多糖和生长因子相结合时，多糖中的硫酸化基团首先和生长因子中的碱性氨基酸残基相结合，使其不被迅速降解。因此肝素与类肝素物质通过与生长因子的特异结合性，控制其缓慢释放，从而更好地发挥生长因子对细胞的诱导及刺激分化作用。硫酸化的γ-PGA与肝素结构类似，同时是一种微生物发酵产物、可降解、降解产物无毒，无异源病毒污染，并且比肝素使用更加安全、可靠。所以可采用γ-PGA-S72作为温敏水凝胶载体中保护生长因子活性和控制释放生长因子的大分子物质，制备功能性生物载体。

查阅国内外文献发现，目前尚无将γ-PGA-S72和PNIPAAm相结合的报导。本发明综合考虑了γ-PGA-S72的生物相容性和能够保护生长因子缓慢释放的特点，采用半互穿网络技术，将γ-PGA-S72引入到PNIPAAm水凝胶网络中，制备得到结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，提高传统水凝胶的生物相容性、温度响应性、细胞片层脱附和保护并缓慢释放生长因子等特性。