[发明专利]恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列

说明书

技术领域

本发明属于检验检疫领域，但不限于该领域，涉及检测临床样品中恶性疟原虫，是一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列。

背景技术

疟疾是对人类健康危害最严重的传染病之一，疟疾病例中有86％发生在非洲地区，非洲以外地区的疟疾病例80％集中在印度、苏丹、缅甸、孟加拉、印度尼西亚、巴布亚新几内亚和巴基斯坦等国。非洲以恶性疟为主，间日疟分布最广，遍及热带、亚热带、温带的国家和地区，以中美洲和东南亚为多见。

我国自2000年以来疟疾疫情出现回升，其中云南、海南两省较为严重，许多省受到输入性恶性疟的威胁，尤其是境外输入性恶性疟的威胁。随着经济全球化和国际交往的增多，近年来劳务输出人数逐年增加，输入性疟疾病例逐年增多，呈逐年上升趋势。输入性病例大多源于非洲、缅甸等恶性疟高发区劳务输出的归国人员，2008年我国疟疾死亡病例全部为境外劳务回国人员，2009年有21个省(市、区)有输入性恶性疟病例报告，且疟疾死亡也全部为输入病例。因此，关注疟疾疫情，特别是境外输入性恶性疟疫情十分重要。

2009年全国报告恶性疟1027例，占疟疾总报告病例数的7.4％。其中，当地感染的恶性疟130例，占恶性疟报告病例数的12.7％，输入性恶性疟病例897例，占恶性疟报告病例数的87.3％。2010年全年报告恶性疟1258例，占疟疾总报告病例数的16.0％，其中报告当地感染的恶性疟97例，占恶性疟报告病例数的7.7％，报告输入性恶性疟1161例，占恶性疟报告病例数的92.3％，较上年上升29.4％。输入性恶性疟最主要的感染地为东南亚地区和非洲。东南亚有缅甸、柬埔寨、巴基斯坦、印度、印度尼西亚、马来西亚等国家。非洲地区有尼日利亚、安哥拉、马里、加纳、几内亚、赤道几内亚、刚果、利比里亚、利比亚、马拉维、多哥、喀麦隆、莫桑比克、科特迪瓦、南非和肯尼亚等国家，其中东南亚的缅甸，非洲地区的尼日利亚、安哥拉、几内亚、赤道几内亚，是我国输入性恶性疟最多的国家。

恶性疟来势凶险，临床表现复杂多变，热型不规则，起病方式各异，有的表现为呼吸道感染，有的表现为消化道感染，有的表现为急腹症。并且恶性疟可随时出现严重并发症，如脑型疟、急性血管内溶血(亦称黑尿热)等，容易引起误诊，若不及时救治，可出现意识障碍、昏迷、偏瘫、肾功能衰竭、呼吸衰竭而死亡，病死率可达22％-50％，甚至高达70％。因此，恶性疟的早期诊断对于及早实施有效的治疗方案，减少重症病例及死亡病例、防范“二代”病例的发生十分重要。

发热病人血检是全世界公认的和推行的发现传染源唯一可靠可行的办法，在疟疾检测中占有很重要的地位。镜检仍是诊断疟疾的金标准，但其敏感性低，费时费力，漏检率高，还需要有相当经验的检验人员才能做到正确诊断，尤其是在低原虫血症、混合感染，以及需要大样本人群现场检测时，临床应用受到许多限制。因此，迫切需要研制出新的敏感、特异、快速、方便的恶性疟诊断技术。

实时荧光定量PCR技术与传统的PCR技术相比具有特异性和敏感性更强、自动化程度更高以及污染可能性更小等优点。

TaqMan实时荧光定量PCR技术依据目的基因设计合成了一条能够与之特异性杂交的探针，探针结合位置位于上下游引物之间，当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5’→3’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上解离下来，破坏了两个荧光基团之间的荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energytransfer，FRET)，而发出荧光，解离下来的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此根据反应体系中的荧光强度即可计算初始模板的数量。

恶性疟原虫的实时荧光定量PCR检测，包括两大步骤，首先是从标本中将恶性疟原虫核酸提取出来，然后再用实时荧光定量PCR技术对目的基因进行检测。疟原虫的裂殖子进入红细胞内发育增殖，被感染的红细胞最终被胀破，裂殖子、疟色素和其他代谢产物一起进入血流，引起一次临床发病。疟原虫检测标本，通常有两种，全血标本和滤纸干血片标本，后者由于便于现场采集、保存和运输，可以满足现场人群大规模筛查疟疾采样、特殊情况下(如在口岸现场)采样或在边远地区采样的需要，被广泛采用。