[发明专利]长滩军团菌的荧光原位杂交检测试剂盒在审

专利信息
申请号: 201410202061.6 申请日: 2014-05-13
公开(公告)号: CN104711342A 公开(公告)日: 2015-06-17
发明(设计)人: 朱庆义;顾全;胡朝晖;严慧 申请(专利权)人: 广州金域医学检验中心有限公司
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
代理公司: 代理人:
地址: 510000 广东省*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 军团 荧光 原位杂交 检测 试剂盒
【说明书】:

技术领域:

发明涉及长滩军团菌检测鉴定的技术领域,具体为一种长滩军团菌的荧光原位杂交检测试剂盒。

背景技术:

军团菌是一类革兰氏阴性的兼性胞内寄生菌,广泛分布于自然环境与人工水体环境中,主要以空气气溶胶的形式进入肺泡,并以胞内寄生的方式感染人体细胞,可引起军团菌病。目前军团菌属共有58个种,20多个种与人类疾病有关,其中嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、长滩军团菌(L.longbeachae)和杜氏军团菌(L.dumoffii)为主要病原体。长滩军团菌于1980年首次分离于美国长滩市的一位军团菌肺炎患者,并因此得名。同年,William分离得到长滩军团菌的第二个血清型,此后便不断有长滩军团菌的临床和环境分离报道。在澳大利亚,新西兰等地,长滩军团菌感染病例数量与嗜肺军团菌相当,有些地区甚至多于嗜肺军团菌感染病例。有研究表明,欧洲军团菌肺炎患者中,大约5%病例源自长滩军团菌感染,并在过去的十年间呈显著增多的趋势。在亚洲,日本近年来也发现长滩军团菌感染的军团菌病患者。与嗜肺军团菌以空调系统产生的气溶胶为主要传播途径不同,长滩军团菌主要存在于堆肥处理的土壤以及附近水体中。流行病学调查表明,长滩军团菌病例大多在患病前接触了含有长滩军团菌的土壤或附近水体。我国军团菌的研究多集中在城市空调系统或环境水系中嗜肺军团菌的分离与培养,而长滩军团菌的相关研究基本处于空白,更无土壤中长滩军团菌的分离研究报道,长滩军团菌对我国人群的危害尚不清楚。

目前长滩军团菌的检测鉴定主要采用分离培养,血清凝集实验,生化反应,16S rRNA基因和mip基因测序鉴定等方法。传统分离培养方法耗时长,分离难度大。血清凝集容易出现交叉凝集反应,生化反应鉴定重复性差,基因测序耗费大。因此需要一种简单的长滩军团菌特异性检测方法。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种特异性的微生物图像检测方法。荧光标记的核酸探针与微生物胞内高度相似的核酸位点杂交,并在激发光照射下发射荧光,可用于微生物的检测和定位。目前已有针对军团菌属和嗜肺军团菌种的特异性FISH探针,并广泛运用于环境、临床等样品的检测。本发明设计了一个长滩军团菌的特异性FISH检测试剂盒用于长滩军团菌的检测。

发明内容:

本发明的目的是提供一种长滩军团菌的荧光原位杂交检测试剂盒,本发明基于我们在16S rRNA序列中新发现的一个长滩军团菌特异的探针结合位点,建立一种更为简单、快速、且成本低廉的长滩军团菌检测试剂盒。

本发明实现过程如下:

1.荧光原位杂交探针设计与合成:

通过对长滩军团菌、非长滩军团菌与其他非军团菌的16S rRNA序列比对,发现长滩军团菌在该序列上存在一段特异性区域“GGATGATGTCTGAGGACG”,其他非长滩军团菌与非军团菌在此区域至少存在一个碱基差异。据此我们设计一条长滩军团菌特异探针,通过该荧光原位杂交探针可鉴别军团菌与其他细菌。委托商业探针合成公司合成探针:

探针:[FITC]-5’-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列为SEQ ID NO:1)

FITC:异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate),通过一个氨基连接分子与探针5’端相连。

2.试剂盒的制备

含有上述引物的军团菌检测试剂盒,其主要成分为:

(1)探针:上面1.荧光原位杂交探针设计与合成中制备的探针以无菌蒸馏水溶解,配制成浓度10ng/μl。

(2)荧光原位杂交缓冲液:20mM Tris-HCl,20%甲酰胺,900mM NaCl。

(3)荧光原位杂交洗脱液:20mM Tris-HCl,0.01%SDS,225mM NaCl和5mM EDTA。

(4)阳性对照:长滩军团菌标准菌株(ATCC33462),0.5ml1×104个菌/ml培养物。

(5)阴性对照:嗜肺军团菌标准菌株(ATCC35072),0.5ml1×104个菌/ml的嗜肺军团菌培养物。

以上试剂盒在-20℃保存。

3.试剂盒使用

(1)样品前处理:将待检测样品和对照制成4%多聚甲醛菌悬液,置于4℃过夜固定。12000rpm离心3分钟,弃上清,以PBS缓冲液(PH=7.6)重悬菌液。取20μl菌液均匀涂于载玻片上,室温风干。

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