[发明专利]谷子锈菌巢式PCR高效检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及用巢式PCR（nested PCR）技术对谷子锈菌进行检测，属于植物真菌分子生物学检测技术领域。

背景技术

谷子（Setaria italica）起源于我国，是哺育中华民族的主要粮食作物之一，其种植面积和产量均居世界之首。小米营养丰富，随着世界杂粮热的兴起，出口量在稳步增加，已经成为我国的特色创汇杂粮。谷草是牲畜的优质饲草，在耕地紧缺的情况下是发展畜牧养殖业的首选粮草兼用性作物。但是谷子病害的发生，严重影响着谷子的产量和质量。

谷锈病（Uromyces setariae-italicae）是世界谷子产区经常发生的一种气传流行性病害，严重影响着谷子的稳产和高产。谷子锈病病原菌Uromyces setariae-italicae，属担子菌亚门（Basidiomycotina）、柄锈菌科（Pucciniaceae）、单胞锈属（Uromyces）。谷子锈病在谷子的叶片和叶鞘上都可发生，但在叶片上发生更加严重。发病初期，在叶片表面与叶背面，特别是背面产生隆起的夏孢子堆，夏孢子堆成熟后突破寄主表皮而外露，增强了植株的蒸腾作用，使植株丧失大量水分，减少光合作用面积，一般减产10%-30%，严重时植株倒伏，造成绝产。

在谷子锈病发生的初期阶段，由于潜伏侵染症状并不明显，用传统的病害症状、病原形态学等方法很难进行检测，谷锈病为典型气传流行性病害，等症状明显时已很难进行防控，因此初期诊断非常重要。同时谷锈菌存在许多其他寄主，如青狗尾草、莠狗尾草、倒刺狗尾草、谷莠子等。因此急需找到一种谷锈菌检测方法，以便于对谷锈菌寄主范围进行检测，更加清楚了解其初侵染源。近年来，基于PCR原理的分子生物学技术的发展为植物体内病原菌的快速、准确诊断提供了有效的工具。在真核生物的核糖体DNA（rDNA）中，编码区保守性较强而非编码区具有较大的可变性，是进行真菌分类的有效序列。在非编码区，相对于核糖体基因内转录间隔区( rDNA-ITS)而言，rDNA基因间隔区IGS( intergenic spacer )变异性更高，是真菌内进行种间比较的和分类的重要DNA片段。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。梁宏等根据小麦光腥黑穗病IGS区与小麦矮腥黑穗病菌及小麦网腥黑穗病菌的差异设计特异性引物，对小麦光腥黑穗病菌进行了分子检测；王永强以中国不同地理来源的稻曲病菌菌株为材料，对其IGS序列进行了初步的比较分析，为稻曲病菌种下群体的鉴定奠定了基础。本研究基于真菌rDNA-IGS区域，设计了检测谷子锈菌的巢式PCR特异性引物，为快速、准确的检测谷子锈菌提供了技术支持，能够更早、更及时的发现病原菌，对谷子锈病的早期检测和防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种利用巢式PCR技术检测谷子中锈菌的方法，通过该方法可快速诊断出谷子植株中是否携带锈菌，具有特异性强、灵敏度高的特点，为锈病的早期诊断、科学预防和病情的控制提供了技术保障。

本发明的具体步骤是：

1、提取基因组DNA

采用CTAB法提取谷子锈菌、其它供试菌株以及接种锈菌的谷子叶片基因组DNA。以IGS通用引物扩增锈菌基因组DNA，其上游引物和下游引物碱基序列如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。PCR扩增获得720bp的特异性片段，片段回收纯化后与PMD19-T载体连接过夜，利用热激法转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，通过菌落PCR法检测阳性克隆，把阳性克隆送上海生工进行测序，测序分析后获得谷锈菌IGS序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

2、第一轮PCR扩增

以第1步提取的基因组DNA为模板，采用谷子锈菌IGS区外侧特异性引物对Urs1-F/Urs1-R，经PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；

引物序列：SEQ ID No.4   Urs1-F：5'-GCCTCTAAGTCAGAATCCGTGC-3'；

SEQ ID No.5   Urs1-R：5'-GACGGGATGCGGTAAGTTCA-3'；