[发明专利]一株埃博霉素高产菌及其在发酵产埃博霉素中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株埃博霉素高产菌及在发酵生产埃博霉素中的应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

埃博霉素具有很强的抗肿瘤活性，能在较低的浓度杀死癌细胞。为此选择合适的产埃博霉素菌种价值重大。它与紫杉醇具有相同的抑制肿瘤细胞生长的作用机制，并且对多重耐药肿瘤细胞和耐紫杉醇的肿瘤细胞均表现强大的抗癌活性。除具有活性方面的优势之外，埃博霉素具有较紫杉醇简单的化学结构和良好的水溶性，而且可以发酵法生产。因此从1995年发现Epothilone的微管解聚抑制活性以来，其相关研究已引起全球的极大的热情和关注。紫杉醇现有资源破坏严重，后续资源严重不足，埃博霉素作为紫杉醇的优质替代品，不仅是一种优质的产品，更是一种宝贵的资源，被越来越多的学者认为是抗癌药物的一次新的革命。

      埃博霉素不仅可以应用化学法合成，同时也可以通过生物合成。但化学合成埃博霉素步骤过长，杂质片段过多，产率较低，合成方法正在逐步完善。生物合成主要是通过粘细菌发酵来生产埃博霉素，生物发酵主要产生埃博霉素a和埃博霉素b，在相关人体细胞系中研究后发现，埃博霉素a抗癌效果弱于紫杉醇，而埃博霉素b抗癌效果强于紫杉醇，目前主要以埃博霉素b的效价来衡量产量。但目前埃博霉素在粘细菌中产量较少，美国BMS已能达到228mg/L的埃博霉素产量（a:b=1.6），国内山东大学已经能达到最高180mg/L的埃博霉素产量(a：b=2)（ 李越中，胡玮，刘红. 一株耐碱纤维堆囊菌及其在制备埃博霉素中的应用：CN101402929A[P],2009-4-8)，埃博霉素的发酵提升仍有很大潜力。

     自然界中产埃博霉素能力强，并且可以用于工业生产的理想菌种只有溶纤维素粘细菌。为了提高发酵产埃博霉素的产量，降低生产成本，提高生产质量，国内外对其进行了大量研究，例如：优良生产菌种的诱变筛选、原料成本的优化、生产工艺的改良等方面。由于埃博霉素在粘细菌中产量较少，所以目前研究热点则主要集中在埃博霉素生产菌种的诱变筛选上。本发明菌株采用的离子束诱变育种是一种交叉物理学和生物学的新型诱变方式，和经典诱变方法相比，在遗传稳定性，诱变频率性上有巨大优势。经过相关文献、专利的检索，国内外利用这一思路筛选埃博霉素高产菌的相关技术和方法尚无报道。

发明内容

    本发明的目的是提供一株埃博霉素高产菌及在发酵生产埃博霉素中的应用，诱变方法简单、高效、安全，得到的埃博霉素高产菌能大幅度提高发酵产生埃博霉素效价。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一株埃博霉素高产菌株，分类命名为溶纤维素粘细菌（Sporangium cellulosum） YU-970，已于2014年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2014144。

本发明所述的埃博霉素高产菌的筛选方法是：将从江苏高淳游子山国家公园腐败树枝周围的土壤中分离纯化出的溶纤维素粘细菌做出发菌种，经低能氮离子注入诱变后，通过初筛、摇瓶发酵复筛获取埃博霉素高产菌作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出埃博霉素产量高的作为目标菌株。

本发明菌株溶纤维素粘细菌 YU-970的形态学及生理化学特征如下：

    菌落颜色：淡黄色；

    需氧方式：兼性厌氧；

    菌落大小：3~8μm；

    适宜生长温度：30~35℃；

    适宜生长pH：6.0~7.0；

    菌落形态：圆柱形；

    革兰氏染色：阴性。

    本发明所提供的埃博霉素高产菌诱变方法，具体步骤如下：

    （a)、单细胞悬浮液制备：将出发菌株溶纤维素粘细菌YU-1制成细胞悬液，调整浓度为10⁶/毫升。

  （b)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL的步骤(a)中细胞悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20~30KeV注入剂量为140×10¹³ions/cm³下，对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1mL无菌水洗脱，涂布到M26培养基上，在30~35℃下倒置培养5~7d。

   (c)、 诱变菌株的筛选：