[发明专利]血小板衍生生长因子B突变体、其制备方法及用途

说明书

本发明涉及血小板衍生生长因子B衍生物，具体地，本发明涉及血小板衍生生长因子B突变体，编码该突变体的核酸分子，含有该核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及所述突变体的制备方法和纯化方法，以及所述突变体用于制备促进细胞分裂、增殖、促进伤口愈合、皮肤再生、骨骼与牙齿缺损再生、关节修复的药物中的用途。

技术领域

本发明涉及血小板衍生生长因子B衍生物，具体地，本发明涉及血小板衍生生长因子B突变体，编码该突变体的核酸分子，含有该核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉及所述突变体的制备方法和纯化方法，以及所述突变体用于制备促进细胞分裂、增殖、促进伤口愈合、皮肤再生、骨骼与牙齿缺损再生、关节修复的药物中的用途。

背景技术

血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)是一种能多种细胞产生的、能够刺激间质来源细胞增殖的多肽，上世纪70年代首先由Ross等从血小板中发现，因而得名(1)。到目前为止，共发现4种PDGF单体PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D。这些单体彼此通过链内及链间二硫键，形成5种同源或异源二聚体：PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD(2,3)。普遍认为PDGF基因和蛋白属于一类在结构与功能上相关的生长因子家族，这个家族还包括血管内皮生长因子(VEGFs)以及胎盘生长因子(PIGF)(4)。PDGF通过激活其受体PDGF-R发挥生理功能。PDGF-R包括PDGFR-α和PDGFR-β两种，属于酪氨酸激酶受体。配体与受体结合引发受体单体的二聚化，促使胞内区的酪氨酸残基自体磷酸化而激活。两种受体可以激活多条信号通路关键分子，如Ras-MAPK、PI3K和PLC-γ(5)，进而激活相关基因的转录，刺激细胞生长、抑制凋亡，促进分化，引起定向移动和迁移等，发挥多种多样的生物学功能。

PDGF-b基因定位于第22号染色体，含有7个外显子基因，编码241个氨基酸组成的前体蛋白，经蛋白酶水解加工形成的最终成熟产物是109个氨基酸组成的，分子量为12.3kD的多肽。在生物体内，PDGF-B蛋白的活性形式是由两条单体通过二硫键形成同源PDGF-BB或异源二聚体PDGF-AB(6)。每条PDGF-B蛋白单体含有8个高度保守的半胱氨酸残基，其中6个半胱氨酸两两形成链内二硫键(CysⅠ-Ⅵ，Ⅲ-Ⅶ，Ⅴ-Ⅷ)，另外两个则与对应单体之间交叉形成链间二硫键(CysⅡ-Ⅳ)(7)共同形成PDGF蛋白家族特征性的生长因子结构域—半胱氨酸结。这些链内及链间二硫键构成了PDGF-BB二聚体蛋白复杂的空间结构(图1B)。

另外，PDGF蛋白在表达合成时还存在不同剪切形式，使得加工成熟后的PDGF蛋白呈现多种结构形式。从人血小板提取物中分离纯化的PDGF-BB，通过N端氨基酸序列分析表明存在至少三种不同的剪切形式，20％Ser1，45％Thr6及35％Thr33，这些切割的异质性，致使在纯化PDGF-BB时各种切割形式的蛋白比例不可控(8)。

发明内容

本发明的发明人经过大量研究，发现特定位点蛋白酶降解和/或糖基化修饰是造成多种PDGF-B存在的主要原因，进而通过位点突变获得了PDGF-B突变体，其蛋白均一性大大提高，并且仍保留PDGF-B蛋白的活性。

本发明第一方面涉及血小板衍生生长因子B突变体，其在野生型血小板衍生生长因子B的第101位和第109位氨基酸位点处具有突变(此处对氨基酸位点位置的描述均以含109个氨基酸残基的成熟PDGF-B为基础，以下同)，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。

根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第6位氨基酸位点处具有突变，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。

根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第32位和/或第33位氨基酸位点处具有突变，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。

根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，与野生型血小板衍生生长因子B相比，其N端缺失5个氨基酸，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。