[发明专利]三个抗草丁膦水稻细胞质型谷氨酰胺合成酶突变体

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一组由人工合成的野生型水稻谷氨酰胺合成酶经DNA改组（DNA shuffling）技术得到的突变基因，该组基因编码的谷氨酰胺合成酶对草丁膦的抗性显著增强。该发明所述的基因可用于构建转化植物的表达载体。

背景技术

转基因抗草丁膦作物是仅次于抗草甘膦作物的第二位抗除草剂作物，已商业化的耐草丁膦作物有玉米、油菜、甜菜、棉花等。2001年加拿大种植的400万公顷油菜中，80％是抗除草剂品种，其中抗草甘膦油菜占47％，抗草丁膦油菜占l3％。草丁膦的杀草原理是它能抑制谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)，使氨在植物体内迅速积累，光合作用和光呼吸停止，叶绿体受损，从而导致杂草死亡。常规作物不具有降解草丁膦的能力，如果直接接触，草丁膦会杀死常规作物。耐草丁膦作物（商品名叫Liberty Link作物）含有来源于微生物的Bar或Pat基因。这两个基因编码的草丁膦乙酰转移酶（PAT）能够催化乙酰辅酶A与草丁膦游离氨基结合，降解被植物吸收的草丁膦，从而消除草丁膦对谷氨酰胺合成酶抑制和植物氨代谢的干扰，赋予植物对草丁膦的耐性。Bar基因来自于潮湿链霉菌（S. hygroscopicus），而pat基因则来自于绿色产色链霉菌（S. Viridochromogenes）。尽管两个基因来源不同，但它们很相似。耐草丁膦作物之所以能够抗草丁膦是因为这种作物具有分解草丁膦的能力，也就是说，草丁膦在接触谷氨酰胺合成酶之前就被草丁膦乙酰转移酶分解掉。为了提高Bar（pat）基因在植物的表达，大多数生产上利用的基因都经过了密码子偏爱改造，但是氨基酸序列没有变化。虽然，小鼠喂毒试验结果表明草丁膦乙酰转移酶能在胃和肠道中彻底分解，在食用过程中不会出现潜在的危害。但是，由于该基因来源于微生物，而不是来源于农作物本身，不同程度上都会造成消费者的抵触心理。

由于谷氨酰胺合成酶是草丁膦的靶标酶，尽管Bar能快速降解草丁膦，但是草丁膦在接触谷氨酰胺合成酶之前很难彻底将其分解，因为很多谷氨酰胺合成酶分布在细胞膜上，因此草丁膦在转Bar基因农作物上应用时，会不同程度地干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。目前抗草甘膦除草剂农作物的培育大多使用对除草剂不敏感的EPSPS基因。但是尚未见对草丁膦不敏感的谷氨酰胺合成酶基因及其商业应用的研究报道或专利，推测可能的原因是自然界缺乏草甘膦分解酶，而bar则对草丁膦具有很强的分解效果。植物中过量表达野生型谷氨酰胺合成酶只能部分缓解草丁膦伤害，如将豌豆来源的野生型GS基因转化小麦，转基因植株可以缓解草丁膦的伤害，但耐性程度不足以商业化应用。

发明内容

本发明的目的在于提供三个草丁膦抗性提高的水稻细胞质型谷氨酰胺合成酶突变基因及其制备方法，所述突变基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No3、SEQ ID No 5所示；所述突变基因的氨基酸序列分别如SEQ ID No 2、SEQ ID No4、SEQ ID No 6所示；其对应的氨基酸突变位点分别为：G245S/G318V、N54S/S115F/G245S、V200A/T293A/R295K。这三个突变基因编码的谷氨酰胺合成酶对草丁膦的抗性显著增强。通过所述的突变基因在酿酒酵母中的表达和草丁膦耐受性的验证，表明改组基因具有构建植物表达载体，获得耐草丁膦植物的应用潜力。

为达到上述目的，本发明主要采用如下技术方案：