[发明专利]用乌头酸酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法

说明书

本发明提供了发酵生产L‑赖氨酸的方法，其包括改造细菌使其乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，用改造的细菌发酵生产L‑赖氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产l-赖氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。

背景技术

通过产l-赖氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产l-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在pnt、dap及ppc等基因上，未见为了L-赖氨酸生产而关注乌头酸酶（如，乌头酸酶A）及其编码基因。

乌头酸酶是三羧酸循环中的一个酶，该酶催化两步化学反应，分别为柠檬酸转化为乌头酸以及乌头酸转化为异柠檬酸。目前已知在埃希氏菌中，acnA基因（其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示）编码乌头酸酶A，但是可能是由于其代谢距离最终的l-赖氨酸产物太远，中间代谢分支太多且复杂，而在l-赖氨酸发酵中一直未引起人们的重视。

本发明人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现acnA基因的改造能够有助于提高l-赖氨酸的产量；然而，现有技术要么通过增加拷贝和/或定点突变导入表达量和/或酶活性提高的有益的酶基因，要么通过敲除不利的基因以使之酶活性和/或表达量消失，但是与之不同的是，本发明人发现，acnA基因不能简单地提高或敲除，尤其是敲除后使得细菌生长困难，难以实际应用，因此开发了新的针对acnA基因调控的方法，以此来提高l-赖氨酸的产量，而且该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产l-赖氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产l-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高l-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产l-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高l-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、载体和/或细菌等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产l-赖氨酸的方法，其包括：

（1）改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产l-赖氨酸。

在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，改造成能够使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失的新的acnA基因。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。