[发明专利]一种延长水稻生育期的育种方法

权利要求书

1.一种延长水稻生育期的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 

步骤1，在水稻生育期决定基因Ehd3外显子区选取靶标片段，所述靶标片段的双链结构的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，(N)_X代表数目为X的一段碱基序列{N₁,N₂……N_x}，X代表碱基的数量，N₁,N₂……N_x中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也表示A、T、G、C中的一种； 

步骤2，利用所述靶标片段，构建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框，以及Cas9核酸酶表达框； 

步骤3，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达； 

步骤4，剪切Ehd3基因的双链靶标片段，诱发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内Ehd3基因的功能缺失突变； 

步骤5，用导入所述重组载体的水稻细胞再生水稻植株； 

步骤6，对再生植株中Ehd3基因包含靶标片段的DNA区段测序。 

步骤7，选择两个等位Ehd3基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，观察再生株系子代的生育期，挑取生育期推迟超过预定时间段的株系，作为所创制的生育期推迟的水稻材料。 

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，X为19或20。 

3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框均能够在水稻细胞中表达。 

4.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表 达框的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。 

5.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于， 

所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1至246位所示；结构特征为(N)_X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第351至358位所示。 

6.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于， 

所述Cas9核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.2第1至2031位所示；植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID No.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.2第6347至6599位所示。 

7.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，在所述步骤7中，挑取子代生育期推迟超过两周的株系作为所创制的生育期推迟的水稻材料。 

8.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤7还包括对所得植株进行自交，观察再生株系子代的生育期。