[发明专利]在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在水稻中检测受白叶枯病菌诱导表达基因的有效方法，属于分子遗传学领域。

背景技术

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性黄单孢菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo.)所引起的一种世界性细菌病害，它与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻遭遇白叶枯病后，一般减产20～30％，严重时可达50％，甚至绝收。利用水稻的抗病基因是防治白叶枯病最经济、环保的方法，也是水稻育种中提高杂交稻抗病性的有效途径。水稻抗白叶枯病基因往往受白叶枯病菌的诱导表达，所以在白叶枯病菌侵染的水稻中检测被诱导表达的基因，是发现抗性基因的有效方法，为水稻抗性基因的功能研究和育种利用奠定坚实基础。

目前，检测基因表达的方法非常成熟，主要有半定量RT-PCR法、Real-time PCR法、Northern blotting法等。其中，Real-time PCR可以精确定量某个基因的表达水平，是比较公认的检测基因表达的方法。在检测白叶枯病菌诱导表达的基因时，一般是选取一段接种过白叶枯病菌的水稻叶片，提取总RNA后，用Real-time PCR分析基因表达水平。由于不同基因的表达方式可能有所不同，有些可能是在叶片接种病菌的局部受到诱导表达，有些则是在整张叶片上受到诱导表达，因此如何合理地选取叶片组织是检测基因受白叶枯病菌诱导表达一个非常关键的因素。但是，选取哪一段接种过白叶枯病菌的水稻叶片，离接种处多少距离，才能有效地检测出被诱导表达的抗性基因，目前还没有一个明确的标准。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法；采用本发明的方法能轻易的对白叶枯病菌侵染的水稻组织进行选取，并能有效地检测其诱导基因的表达。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，采用Real-time PCR，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌(白叶枯病菌PXO86)，侵染(接种)46～50小时(较佳为48小时)后，取距离剪口处1cm(包括1cm)之内的叶片组织进行检测。

作为本发明的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法的改进：在水稻分蘖期，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌。

作为本发明的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法的进一步改进：

表达基因为Os03g0853200、OsPR1b、OsNPR1等；

当表达基因为Os03g0853200时，引物为：

5’-GAGCAACGACCAACAAAAG-3’和5’-GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3’；

当表达基因为OsPR1b时，引物为：

5’-GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’和5’-CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3’；

当表达基因为OsNPR1时，引物为：

5’-CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’和5’-GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3’。

本发明的方法提供了有效的取样方法，采用本发明的方法能最有效地检测到基因受白叶枯病菌的诱导表达。

本发明的过程如下：

通过Real-time PCR技术，发明人发现了水稻一个基因(GenBank accession:Os03g0853200)受白叶枯病基因的诱导表达，在动物中该基因的同源基因参与机体的免疫应答。为了分析该基因(Os03g0853200)在接种白叶枯病菌的水稻叶片中的表达情况，发明人首先采用剪叶法(Kauffman et al.,1973)对水稻抗病品种IRBB7和感病品种IR24接种白叶枯病菌，用沾了菌液的剪刀在叶片顶端横向剪去一段，在剪过的伤口处白叶枯病菌会沿着维管束向叶片基部方向侵染；然后，根据离剪口的距离，将接种的叶片分成I至V区域(图1)，每个区域的叶片组织独立提取总RNA和反转录成cDNA，用Real-time PCR分析该基因的表达水平。结果表明该基因在感病品种IR24中没有被诱导表达，而在抗病品种IRBB7中被显著性地诱导表达。不过，在叶片I至V区域中该基因表达被诱导的程度不同，在I区的表达量最高，随着距离剪口处越远，基因表达越低，在Ⅱ区的表达量只有Ⅰ区的一半，到Ⅳ区已趋于本底表达，无诱导表达。以上结果表明，在I至III区域内都能非常明显地检测到该基因受白叶枯病菌的诱导表达，但是在I区检测到的表达量最高，即在距离剪口处1cm以内可最有效地检测到基因受白叶枯病菌诱导的表达(图2)。