[发明专利]一种磷脂酶Dα活性的测定方法

权利要求书

1.一种检测磷脂酶Dα活性的方法，其特征是；具有以下的过程和步骤：

A．制作用酶联比色法测得的红色产物的吸光度值与其相应的胆碱含量标准关系曲线；具体步骤是；取50%磷脂酰胆碱水溶液按照梯度系列稀释成11组不同浓度的胆碱水溶液，编号，分别加入显色液0.8mL(含45mmol/L的pH8.0 Tris-HCL <三羟甲基氨基甲烷-盐酸混合溶液>、0.8单位胆碱氧化酶、2.4单位HRP <辣根过氧化酶>、0.24mg 4-ATT <4-氨基安替匹林>和0.16mg重蒸酚)；30℃反应90min，色泽稳定后加1mL Tris-HCL（含2g/L Triton X-100 <聚乙二醇辛基苯基醚>，pH8.0）；用0.22μm孔径滤膜滤去蛋白质，测吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据胆碱的含量与所测得的吸光度值之间的关系绘制标准关系曲线；

B． 用酶联比色法检测待测磷脂酶Dα催化水解磷脂酰胆碱一系列反应后产生的红色物质的吸光度值，根据上一步骤制作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲线，确定生成胆碱的含量，以此推算出待测磷脂酶Dα的活性；具体步骤是：取200μl磷脂酶Dα反应系（做三个平行样），其中含终浓度为0.1mmol/L DMG(二甲基戊二酸，pH6.5)，10mmol/L MgCL₂，10mmol/L CaCL₂，5mmol/L亚油酸，10μg PLD粗酶液；最后加入12mmol/L磷脂酰胆碱；封口后30℃保温反应30min，沸水浴10min终止反应；冷却后加入显色液0.8mL(含45mmol/L的pH8.0 Tris-HCL、0.8单位胆碱氧化酶、2.4单位HRP、0.24mg4-ATT和0.16mg重蒸酚)，30℃反应90min，色泽稳定后加1mL Tris-HCL（含2g/L Triton X-100，pH8.0）；用0.22μm孔径滤膜滤去蛋白质，测吸光度值；根据A步骤制作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲线，确定生成胆碱的含量，以此推算出待测磷脂酶Dα的活性。

2.根据权利要求1所述的一种检测磷脂酶Dα活性的方法，其特征是；在200μl磷脂酶Dα的活性测定反应系中蛋白质含量为10μg。

3.根据权利要求1所述的一种检测磷脂酶Dα活性的方法，其特征是；在200μl磷脂酶Dα的活性测定反应系中Ca²⁺浓度为10mM。