[发明专利]利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程领域，具体涉及利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法。 

背景技术

①动物特殊生理状况使体内分泌消化酶不足，不能很好的消化利用饲料中的营养物质。②饲料中的植物性抗营养因子的影响。因此，开发和应用饲用酶制剂可以极大的缓解饲料资源不足，饲料利用率低等问题，为我国养殖业找寻一条可持续发展的道路。 

添加外源消化性的酶制剂可以弥补畜禽内源消化酶的不足，利于动物对饲料的消化吸收，提高饲料的利用率；添加外源非消化性的酶制剂可以降低或消除饲料中的植物性抗营养因子的影响，提高动物对饲料的消化利用率。胰脂肪酶作为动物体内分泌的一种消化水解酶类，在动物消化利用饲料脂肪方面起着重要作用。胰脂肪酶属于酶制剂中的一种，将其应用于动物生产中特别是动物幼龄阶段具有良好的经济效益和社会效益。 

相比于纤维素酶制剂、蛋白酶制剂和淀粉酶制剂，脂肪酶制剂在动物营养的酶制剂研究中所占比重较小，还有很多工作需要做。 

酵母表达系统具有生长快、操作简单，利于大规模发酵生产等优点，同时真核生物能对表达的外源蛋白质进行翻译后修饰，使得表达的蛋白具有生物学活性等优点。研究发现，毕赤酵母遗传背景清楚，易操作；与日常生活密切，安全，无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；工艺简单成本较低等特点。目前未见关于毕赤酵母分泌表达猪胰腺脂肪酶制剂的报道。 

发明内容

鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母高效分泌表达重组猪胰腺脂肪酶PPL的方法，该方法通过毕赤酵母分泌表达获得猪胰腺脂肪酶；并且通过密码子优化提高猪胰腺脂肪酶的表达量，表达的重组猪胰腺脂肪酶具有与商品脂肪酶相同的酶学活性，同时本方法对猪胰腺脂肪酶的真核表达研究具有重要意义。 

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案： 

一种利用毕赤酵母分泌表达猪胰腺脂肪酶PPL的方法，包括以下步骤：

（1）提供猪胰腺脂肪酶基因PPL序列，以及密码子优化后的基因序列rePPL；

（2）构建酵母细胞中表达rePPL的重组质粒pPICZαA-rePPL；

（3）重组质粒pPICZαA-rePPL转化毕赤酵母X-33细胞；

（4）鉴定并筛选出高表达转化菌株；

（5）培养转化菌，获得重组猪胰腺脂肪酶rePPL；

（6）重组猪胰腺脂肪酶rePPL的鉴定以及酶学活性分析。

所述步骤（1）中猪胰腺脂肪酶基因序列（不含信号肽序列）如SEQ ID NO:1所示。 

所述步骤（1）中密码子优化后的基因序列rePPL是对SEQ ID NO:1序列的前534bp的碱基进行毕赤酵母密码子优化，得到序列oPPL：SEQ ID NO:2，然后利用527-533bp处的BamH I酶切位点，把SEQ ID NO:1的前533bp序列换成SEQ ID NO:2，得到优化后的基因序列rePPL：SEQ ID NO:3。 

所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad公司电转化仪预设PIC程序。 

所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用荧光定量PCR的方法对高表达转化菌进行筛选、鉴定。 

所述步骤（5）中，培养转化菌的培养条件为30℃，200 r/min，0.5%的甲醇，3-5天。 

所述步骤（5）中，重组猪胰腺脂肪酶rePPL存在于培养酵母菌X-33的菌液上清。 

所述步骤（6）中，重组猪胰腺脂肪酶rePPL的鉴定方法是过6×His标签介质，纯化，进行SDS-PAGE电泳。 

本发明的有益效果在于：1）通过毕赤酵母分泌表达系统获得重组猪胰腺脂肪酶；2）密码子优化后，高效表达重组猪胰腺脂肪酶，表达产物的酶学活性和商品脂肪酶活性基本相当。3）本发明通过密码子优化，提高了酵母表达体系中重组猪胰腺脂肪酶的表达量，从而具有大规模发酵，商业化生产重组猪胰腺脂肪酶PPL的潜力和价值。 

附图说明

图1为重组质粒pPICZαA-rePPL的构建过程示意图。 

图2为rePPL基因的PCR产物及酶切电泳图，其中，泳道M为DNA Marker（2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），泳道1为rePPL的PCR产物，泳道2为pPICZαA-rePPL的双酶切（XhoI和Xba I）产物。