[发明专利]斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞周期蛋白H基因序列，具体地说，是涉及一种斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列，本发明还涉及该斑斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，属于分子生物学中基因克隆领域。

背景技术

细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞分裂期(即M时期)，在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。

周期蛋白H基因做为CAK的重要组成部分，从酵母到人类具有高度的保守型。CAK的激活需要周期蛋白H基因与CDK7及MAT1结合，通过对CAK的磷酸化来实现其激酶活性。周期蛋白H基因也参与通用转录复合物TFIIH的构成。TFIIH是一个多蛋白复合物，在转录、DNA修复及细胞周期调控中起重要作用。与其他周期蛋白相比周期蛋白H基因在整个细胞周期中表达量稳定，所有周期时相均有表达。另有证据表明CDK2、CDK4及CDK6等的磷酸化都与周期蛋白H基因密切相关，周期蛋白H基因通过对这些底物的磷酸化从而实现对细胞周期的准确调控，进而可以实现对卵巢发育的调控。

长期以来，斑节对虾的人工繁育问题一直都是限制斑节对虾养殖产业发展的技术瓶颈。在实际生产过程中，亲虾的性腺成熟参差不齐，难以集中育苗的问题是对虾养殖过程中一个非常重要的限制因素。眼柄切除手术作为促进亲虾性腺同步成熟的常用方法，对亲虾本身存在非常大破坏性，不利于可持续养殖，加大了养殖成本。因此出于寻求一种新的对虾繁育方法的需求，对对虾卵巢发育机理及其分子调控机理进行研究势在必行。

发明内容

针对上述问题，本发明以实验室高通量测序获得的EST序列为基础，设计PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白H基因的全表达序列，有利于探究斑节对虾卵巢发育相关机理，并为发现新的催熟方法提供一定的理论支持。

为解决前一技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：该斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供的后一技术方案是这样的：该斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，依次包括下述方法：

1)总RNA的提取

对斑节对虾解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃组织，并分别将各组织溶于Trizol中匀浆，提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，保存；

2)cDNA第一链的合成

将步骤1)中的斑节对虾总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链；

3)斑节对虾细胞周期蛋白H基因的PCR扩增、克隆

以步骤2)合成的第一链cDNA作为模板利用降落PCR法，用接头引物和cycH-F1、cycH-F2对目的基因的3ˊ末端进行两次PCR扩增得PCR产物；

4)对斑节对虾细胞周期蛋白H基因的测定

对步骤3)所得到的PCR产物分离检测、纯化后，再将PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，测序；

5)斑节对虾细胞周期蛋白H基因的分布和表达

a)提取斑节对虾不同组织以及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册进行反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA稀释作为模板，采用SYBR Green Ⅰ染料法，在Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析；

b)依照TaKaRaPrimeScriptTM RTPCR Kit试剂盒说明书进行PCR反应，实验数据采用相对ΔCT法分析斑节对虾细胞周期蛋白H基因在各样品中的相对表达量。

进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，步骤2)所述的反转录引物反转录引物为：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3。

进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的反转录酶为M-MLV。

进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，步骤2)所述的反应条件：42℃60min，70℃15min。

进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，步骤3)所述的接头引物为：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC<3。