[发明专利]用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法

说明书

技术领域

本发明属于青贮领域，具体涉及一种用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法。

背景技术

青贮是通过乳酸菌的增殖，将原料中的发酵底物转化成乳酸等酸性物质，创造酸性环境，抑制有害微生物增殖，从而保存原料营养成分的过程。优质青贮饲料不仅保持了青绿饲料的鲜绿和大部分营养，而且增加了粗蛋白的含量；同时又具有芳香的酸味，柔软多汁，适口性好等特点。在青贮饲料中含有多种乳酸菌，包括乳杆菌（lactobacillus）、肠球菌（Enterococcus）、明串珠菌（Leuconstoc）、乳球菌（Lactococcus）和片球菌（Pediococcus）等，为提高青贮品质，分离饲料中优质乳酸菌显得尤为重要。欧盟国家和美国的研究者对乳酸菌在青贮饲料中的应用进行了大量深入的研究，研究内容包括优良乳酸菌的筛选、其对青贮饲料发酵品质和二次发酵抑制作用的影响、以及青贮饲料添加乳酸菌在奶牛饲养中的应用等。例如，有学者指出附着在新鲜牧草上的微生物，特别是乳酸菌，对青贮料的发酵过程和品质起重要作用。乳酸菌和其它种类的微生物在青贮发酵过程中共同生长，且影响到青贮料的发酵特性。在发酵过程中，牧草中的乳酸菌将糖转变为乳酸，最终pH值降低，而牧草得以保存。

目前市面上的乳酸菌添加剂多是针对玉米的菌剂，用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂还未见报道。南方地区常年阴雨天气较多，干草调制受天气条件影响不易成功，而青贮不受天气条件影响，是保存牧草的有效方法，作为我国南方地区广泛种植的牧草多花黑麦草来说，开发针对其青贮料的乳酸菌添加剂有重要的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高青贮料的发酵品质和营养价值的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂，所述添加剂由第一菌种和第二菌种混合而成，其中第一菌种为植物乳杆菌LP，第二菌种为乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一种菌种，所述第一菌种与第二菌种的容积比例为1：（1～3）。

进一步的是，所述第二菌种为魏斯氏菌WB。

进一步的是，所述植物乳杆菌LP与魏斯氏菌WB的容积比例为1：3。

本发明还提供了一种制备上述用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂的制作方法，该制作方法包括以下步骤：

A、制备乳酸菌培养基，将培养基各组分加入容器中，然后进行加热搅拌，待所有组分都充分溶解后，装入培养皿中并将其密封，然后将其放置于高压灭菌炉中进行灭菌处理，灭菌处理结束后，取出培养皿，将其放置于无菌操作台上，开启紫外灯对其照射一段时间，照射结束后吹风使培养基凝固；

B、制备多花黑麦草的绿汁发酵液，将多花黑麦草原料剪切成2～3cm长的碎段，将切碎后的原料加入高速组织匀浆机中，再加入无菌蒸馏水进行搅碎，将搅碎的汁液用纱布过滤，用量筒称量滤液容积，加入相应重量的葡萄糖以使滤液中葡萄糖浓度达到20g/L，充分混匀后倒入容量瓶中，滤液要装满容量瓶且不留空气，将容量瓶盖子盖好并用胶布缠绕密封；

C、从绿汁发酵液中分离、纯化乳酸菌，将步骤B制得的绿汁发酵液置于30℃恒温培养箱中厌氧发酵48h，从绿汁发酵液放置在30℃恒温培养箱中厌氧发酵开始，每隔4h在无菌操作台上打开一瓶绿汁发酵液，用接种针蘸少许中层发酵液后在培养基上进行划线，每瓶绿汁发酵液用三个培养基进行划线，直至第48h全部绿汁发酵液均进行过划线操作为止，将划过线的培养基放置在30℃的恒温培养箱中培养，每隔两天在无菌操作台上用接种针挑取培养基上的单个菌落得到纯的乳酸菌菌株；

D、对挑取的单个菌落进行革兰氏染色并镜检，观察各个菌株在显微镜下的形态特征从而确定菌株的阴性和阳性；

E、对纯的乳酸菌菌株进行生化鉴定，在无菌操作台上用接种针挑取单菌落置于含不同糖类的生化鉴定管中，将生化鉴定管用蜡密封后置于35℃恒温培养箱中培养24h，之后根据生化鉴定管中的显色反应并结合步骤D得出的结论对得到的菌株进行初步分类；

F、对乳酸菌菌株进行分子鉴定，具体步骤如下：首先，提取乳酸菌菌株的基因组DNA，其次，对提取的基因组DNA进行PCR反应，得到琼脂糖凝胶，接着，从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，得到PCR产物，最后，对得到的PCR产物进行测序，根据步骤E得出的结论，将测得的序列与Genbank中的已知序列进行比对，寻找同源性最高的菌种，从而确定菌株的类别；