[发明专利]基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法

说明书

技术领域

    本发明属于细胞遗传学技术领域，具体涉及一种基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法。

背景技术

    染色体核型分析是鱼类细胞遗传学研究的重要内容之一，不仅对认识鱼类的分类系统、进化关系及染色体演化过程具有显著意义，还可为鱼类种质研究及种群鉴定提供细胞遗传学依据。目前鱼类染色体的制作方法最常用的有活体注射法和细胞培养法等。其中，PHA活体注射法，在野外没有良好设备的情况下，此法尤为适用，但这种方法要求剖杀鱼，不利于鱼种的保存，尤其是对稀有鱼类和种鱼不太合适。鱼类外周血中的淋巴细胞在一定PHA浓度的刺激下，可迅速分裂增殖，适合进行染色体的研究。利用微量的外周血进行体外培养来制备染色体可有效解决上述问题，不同鱼类，制片过程、观察方法都不尽相同。

细胞培养法由于鱼类的种属特性、制片季节、PHA质量及操作者的经验等方面的差异，得到的中期分裂相的数量和质量极不稳定。为了降低试验成本，染色体的制备通常使用国产PHA，因未经纯化，具有不同程度的红细胞凝结性，尤其是某些鱼种，血液中红细胞含量丰富，对PHA的促凝效果很敏感，极易造成培养样本的凝集，导致培养失败；此外，染色体制备常用的抗凝剂肝素由于其制剂的纯度高低以及其保存时间长短不等，其抗凝效果也不相同，量大可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂，量少会发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结构，均会影响淋巴细胞转化效率甚至试验失败。因此，每种鱼类成熟的染色体制备条件需要不断摸索和反复试验才能建立，其中，全血样本的处理至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法，该方法能成功有效的分离出淋巴细胞，排除红细胞干扰，提高制备成功率，为保证试验结果奠定基础。

基于全血培养法处理鱼类染色体技术所用全血的方法，包括以下步骤：

步骤1，将试验鱼麻醉，采血，将所得血液与ACD抗凝剂混合，得混合血液；

步骤2，将步骤1所得混合血液与第一培养基混合，得混合液；

第一培养基为0.1% FCS-L-15培养基；

步骤3，将步骤2所得混合液加至体积百分数55～65的 Percoll分离液上，离心，去掉上层血浆，得到血浆层与分离液层交界处的淋巴细胞；

步骤4，将步骤3所得淋巴细胞加入第二培养基中，充分混匀，离心洗涤，得到细胞沉淀物；

二培养基为0.1% FCS-L-15培养基；

步骤5，将步骤4所得细胞沉淀物转至第三培养基中，20～30℃培养72～96h；

第三培养基为L-15培养基。

作为上述发明的进一步改进，所述步骤2中混合血液与培养基的容积比为1:1～1:2。

作为上述发明的进一步改进，所述步骤3中混合液与Percoll分离液的容积比为1:1～3:1。

作为上述发明的进一步改进，所述步骤3中离心条件为350g、18～25℃离心15～30min。

作为上述发明的进一步改进，所述步骤4中淋巴细胞与第二培养基的体积比为1:4～1:5。

作为上述发明的进一步改进，所述步骤4中离心条件为4℃、140g离心10min。

各步骤中的培养基可以根据本领域的相关技术知识进行常规选择，本发明所述的“第一、第二、第三”不构成对培养基的种类是否相同的限定，只是用于描述培养基的使用次序。

影响获取大量鱼类淋巴细胞的因素很多，足量的外周血液的收集、离心力、离心时间、环境温度、个体差异、血液黏稠度、鱼的进化程度等都会影响分离的淋巴细胞数量和纯度，但是，选择最佳质量浓度的细胞分离液是影响淋巴细胞有效分离的关键因素。本发明中所使用的Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，不能穿透生物膜，对细胞无毒害；渗透压低（＜20mo sm/kg H₂O）、粘度小、可形成高达1.3g/ml的密度；此外，其扩散常数低，所形成的梯度十分稳定，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（200-1000g）于几分钟至数十分钟内达到满意的分离效果。分离不同种属外周血中的淋巴细胞要求使用不同质量浓度的分离液，鱼类外周血淋巴细胞质量浓度在1.085～1.075g/ml之间，根据Percoll的浓度配置出55%～65%密度的离心液，当Percoll浓度＜55%或＞65%时，将无法收集到淋巴细胞；同时环境温度控制在18～25℃，可以保证细胞的存活率及最大的细胞分离液的分离效果；血液经过一定比例的稀释可以降低血液自身黏稠度和红细胞的聚集，提高淋巴细胞收获量。