[发明专利]单细胞水平高效扩增基因3＇UTR序列的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从单个真核细胞提取总RNA并利用PCR技术扩增特定基因3′UTR片段的方法，该方法可以快速裂解细胞得到总RNA，然后将其中的mRNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板通过半巢式PCR得到扩增的片段，本发明对了解单个细胞的基因表达调控具有重要的意义。 

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 

基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。在RNA聚合酶的催化下，以DNA为模板合成mRNA的过程称为转录(transcription)。 

基因结构为5′UTR、启动子、编码区、终止密码子和3′UTR，mRNA的降解往往是通过miRNA与3′UTR作用，因此提取单细胞特定基因的3′UTR序列是研究单细胞水平基因表达调控的关键点之一。 

不同于以往研究成数百万个细胞mRNA平均的方法，本方法结合分子生物学技术，提出一种可以从单个细胞扩增基因的技术流程，以此研究单个细胞的基因表达调控。 

发明内容

本发明要解决的技术问题一种从单个真核细胞提取总RNA并利用PCR技术扩增特定基因3′UTR序列的方法，以此研究单个细胞的基因表达与调控。 

本发明的技术解决方案首先该方法首先快速裂解细胞得到总RNA，然后将其中的mRNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板通过半巢式PCR得到扩增的DNA片段，本发明对了解单个细胞的基因表达具有重要的意义具体地说，包括如下步骤： 

1.单个细胞获取：将培养皿中细胞用PBS冲洗2次，用胰酶将贴壁细胞消化下来，用含10％血清的培养基终止胰酶消化，取1ul用适量PBS稀释成每毫升含1000个细胞，然后用96孔板每孔加入1ul上述细胞稀释液，在显微镜下标记出仅含1个细胞的孔。 

2.总RNA制备：在每个含有单个细胞的孔中加入Trizol20ul，放置5分钟，再加入5ul氯仿，放置3分钟，然后4度12000g离心15分钟。 

3.eDNA制备：取步骤2中上清1ul，用逆转录试剂盒进行逆转录。 

4.半巢式PCR：用逆转录引物做下游PCR引物，以要扩增的基因上游引物作为上游引物，步骤3中的逆转录产物作为模板进行PCR。然后以此PCR结果为模板，以要扩增的基因上游引物作为上游引物，以要扩增的基因下游引物作为下游引物再次进行PCR。 

本方法具有如下的优点和效果： 

1.本方法可以对单个细胞样品进行扩增，以此了解细胞基因表达状态。 

2.本方法，具有操作简便、成本低廉、反应灵敏等优点。 

附图说明

图1为半巢式扩增样品PCR中第一次PCR电泳结果。第1、2、3泳道对应样品1、2、3，第4泳道为100bp marker。 

图2为半巢式扩增样品PCR中第二次PCR电泳结果。第1、2、3泳道对应样品1、2、3，第4泳道为100bp marker。 

图3为pMD19 T载体与增样品DNA连接菌落PCR电泳结果。其中1-21为样本1菌落PCR，2为100bp marker，23-25是阴性对照。 

图4为构建质粒的双酶切电泳结果，使用酶为SaII和XbaI。使用酶为SaII和XbaI，1-4泳道为酶切结果，6泳道为1kb marker，7泳道为100bp marker。 

图5为扩增样品DNA的测序结果。 

具体实施方式

实施实例1 

本实例使用乳腺癌BTC520细胞，扩增基因BRCAl3’UTR区域，DNA长度856bp，引物序列由上海生工合成，上游引物序列P1：CAGCCAGCCACAGGTAC，下游引物序列P2：GCCACAGTCTCACTGTC。 

1、单细胞捕获：培养BTC520细胞生长达80％融合后弃培养液。用冰预冷的PBS洗细胞两次，再加1ml胰酶37℃卵育5分钟，加1ml含10％血清的培养基终止胰酶消化，用移液器吹打混匀细胞，取10ul放入离心管中，用PBS稀释，在显微镜下观察细胞密度，反复稀释，直到细胞密度为1000-2000/ml，在96孔板中每个孔内加入1ul上述细胞稀释液，在显微镜下标记处含有单个细胞的孔。