[发明专利]一种金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性的唾液酸酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种唾液酸酶，特别是一种外切唾液酸酶及其在抑制肿瘤迁移中的应用。

背景技术

唾液酸(sialic acid，SA)是一类分布广泛的带负电荷的九碳糖，通过不同的连键方式存在于糖蛋白、糖脂等糖缀合物的糖链末端。在真核生物中，糖缀合物的唾液酸化修饰在稳定细胞膜结构、促进神经发育、信号识别等过程中具有至关重要的作用，哺乳动物细胞糖链唾液酸化与癌症的发生和转移过程呈相关性。

细菌外切唾液酸酶可以水解糖缀合物末端的唾液酸，已有研究报道部分细菌唾液酸酶在生物转化神经节苷脂制备药物GM1，以及治疗脊髓损伤等方面具有应用价值。然而上述报道中所用的菌株多为致病菌或筛选获得的非常见菌株，遗传信息不明确且不易获得、难以培养甚至还具有危害性，另外大多数报道中酶纯化过程繁琐、底物特异性不强，为该类酶的应用推广带来极大的限制。因此，在遗传背景明晰的非致病菌中开发新的外切唾液酸酶显得尤为重要。

本发明中的唾液酸酶来源于阿维链霉菌，是一种常见的工业菌种，进一步研究该酶制备药物GM1的能力并发现该酶能通过对癌细胞表面神经节苷脂上唾液酸的水解，而抑制癌细胞的迁移。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型唾液酸酶，其氨基酸序列如1)或2)所示且通过大肠杆菌表达后纯化；

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

在1)的基础上经过缺失、突变仍保持生物学功能不变的氨基酸序列。

本发明所使用的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)菌株编号为ATCC31267。

编码所述唾液酸酶的核苷酸序列也为本发明要求保护的范围。

能表达权利要求1所述唾液酸酶的载体或用于表达所述唾液酸酶的转基因细胞系均为本发明要求保护的范围。

本发明要解决的另一个技术问题为所述唾液酸酶在抑制癌细胞迁移中的应用。

使用所述唾液酸酶制备获得的对应性抗体也为本发明要求保护的范围。

本发明涉及内容包括如下方面：

1.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3原核表达质粒的构建；其中涉及构建质粒所设计的neuA3基因的特异性引物、阿维链霉菌基因组的获得、pET28a(+)载体的酶切及连接、宿主菌E.coli BL21(DE)的感受态制备及转化；

2.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3在E.coli BL21(DE)中的诱导表达；其中涉及诱导表达的温度、时间、IPTG浓度及摇床转速；

3.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3的分离纯化；其中涉及宿主菌超生破碎的条件、镍柱纯化的条件、酶液的透析条件；

4.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3酶学性质分析；其中涉及该酶反应的最适温度、最适盐离子浓度、最适反应时间、最适pH、二价离子耐受性、热稳定性、酸稳定性以及底物特异性；

5.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3转化总神经节苷脂制备药物GM1的应用；其中涉及猪脑中总神经节苷脂的提取、酶的生物转化体系、转化后产物的脱盐处理及高效薄层色谱(HPTLC)；

6.阿维链霉菌外切唾液酸酶NeuA3抑制癌细胞迁移能力的研究；其中涉及膀胱癌细胞YTS-1的培养、酶液对细胞的处理、划痕实验及胶体金实验。

本发明提供的唾液酸酶具有较强的二价金属离子耐受性、热稳定性和酸稳定性，对α2,3及α2,6连接形式的底物均能进行水解，对猪脑中提取的总神经节苷脂能进行生物转化，制备纯度较高的GM1，同时首次发现该酶能够通过将癌细胞表面神经节苷脂转化为GM1而抑制膀胱癌细胞的迁移。

附图说明

图1为唾液酸酶诱导表达及分离纯化后的SDS-PAGE图；

图2为NeuA3最适反应条件；

图3为NeuA3离子耐受性、热稳定性及pH稳定性；

图4为NeuA3生物转化猪脑中提取的总神经节苷脂制备GM1的HPTLC；

图5为NeuA3处理膀胱癌细胞YTS-1后细胞迁移能力变化；

图6为NeuA3处理YTS-1后细胞表面GM1分布的免疫荧光照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。