[发明专利]长牡蛎溶藻弧菌应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说是适用于长牡蛎(Crassostrea gigas)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)应激实验中进行功能基因表达分析的管家内参基因的筛选。

背景技术

长牡蛎(Crassostrea gigas)，也称太平洋牡蛎(Pacific oyster)，属于瓣鳃纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，牡蛎科，是冠轮动物(Lophotrochozoa)中软体动物门(Mollusca)内的重要分支。其肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。自然分布于日本、中国和韩国，为世界性广布种。太平洋牡蛎作为贝类的“模式种”，一直受到科学家们的广泛关注，尤其是近来牡蛎基因组序列的破译引起更广泛的关注。

长牡蛎天然免疫系统一直是科学家们感兴趣的领域，开放的循环系统，每天都要面对潮间带各种病原菌的挑战，而牡蛎却能应付自如，其体内必然存在完备精细的天然免疫系统。病原菌及相关病原分子应激实验是近年来研究免疫基因对病原菌或相关分子响应机制的重要手段，研究者通过对牡蛎成体进行病原菌刺激，利用荧光实时定量PCR技术研究免疫基因随时间对病原菌的响应。

本研究所选溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)由中国水产科学院黄海水产研究所莫照兰研究员提供，菌株编号YL1。溶藻弧菌属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌。溶藻弧菌是一种常见的海洋致病菌，其数量居海水弧菌类之首，在世界各地海水及河口处分布广泛，能引起贝、鱼、虾、蟹等多种养殖动物的疾病，给各国水产养殖业造成巨大损失。因此溶藻弧菌受到广大贝类免疫系统研究者的关注，是病原菌应激实验常用到的一种菌株。

荧光实时定量PCR(qRT-PCR)具有操作简单，成本较低，灵敏度高的优势，经常被用来研究目的基因的表达。一些对宿主对病原菌应激反应的研究，其转录水平的研究常常基于qRT-PCR实验。而相对荧光定量实验需要表达稳定的管家基因作为内参。管家基因是典型的组成性基因，在稳定或是病原应激的细胞中，管家基因都能相对较稳定表达。但是在不同的实验条件下，管家基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。

发明内容

本发明的目的是筛选长牡蛎(Crassostrea gigas)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)应激实验荧光定量的内参基因。即，基于荧光定量PCR中的相对定量法在长牡蛎溶藻弧菌应激实验中对免疫基因及其他功能基因进行定量分析所用的双基因荧光定量内参基因及其引物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

筛选出长牡蛎溶藻弧菌应激实验荧光定量的内参基因，其特征在于：长牡蛎溶藻弧菌应激实验中两个内参基因为18S rRNA,具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列和28S rRNA具有序列表SEQ ID No:2中碱基序列。

根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述贝类基因18S rRNA和28S rRNA在长牡蛎溶藻弧菌应激实验样品中稳定表达(即，表达量变化小)，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。

根据权利要求1所述的应用，其特征在于：同时使用两个稳定表达的管家基因作为双基因内参；双基因内参的表达量Ct值为两个基因在应激实验样品中的表达量Ct值的算术平均数；通过该双基因内参校正上样过程中的实验误差，能够提高实验的准确性。

根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

18S rRNA的特异性引物为:

18S-F:5’-TTGGTTTTCGGAACACGAGGTAAT-3’

18S-R:5’-TGCTTGGCAAATGCTTTCGCTG-3’,

28S rRNA特异性引物为:

28S-F:5’-AAGGGCAGGAAAAGAAACTAAC-3’,

28S-R:5’-GTTTCCCTCTAAGTGGTTTCAC-3’

具体步骤为：