[发明专利]一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养装置领域，涉及一种适用于三维组织细胞灌注培养的生物反应器，尤其是多种组织器官共培养的生物反应器。

背景技术

通常情况下已构建好的工程化组织（或称三维构建物）需要在体外进行一段时间的培养，使其成熟后才能移植或供研究用，而目前最常用的培养模式是采用培养板进行定期换液的静态培养法，即先移去旧培养液再添加新培养液，然后放入培养箱中予以静置培养，其优点是适合小批量的培养，换液周期可随组织、细胞的不同而采取相应的策略。但其缺点显而易见：一是营养液的消耗呈进行性下降，而代谢产物不断增加，会对细胞造成一些生理性损伤；二是依靠弥散方式提供营养，存在营养供应受限的显著缺点，甚至导致工程化组织内部的细胞得不到营养而死亡；三是周期性换液使营养成分呈周期性波动，不利于细胞的均匀生长。

在体内，丰富的毛细血管网构架起一个有效的传质通道，为细胞提供充足的氧和营养物。因此体外培养时为了保证营养物的供应，须建立培养液有效循环的方法，目前有以下几个策略：滚瓶培养、旋转培养和灌注式培养，其中灌注式培养的优点尤为显著，一方面，由于培养液连续地流经三维构建物内部或周围，能够克服营养物质传递受限的缺点，即使构建物厚度超过500μm也能得到可靠的营养供应；另一方面，灌注培养时的液流能够产生一定的剪切力，提供适当的机械刺激，有利于构建物的发育和成熟。Kalyanaraman等(Kalyanaraman BM, Dorothy MS,Steven TB.Medium Flow Rate Regulates Viability and Barrier Function of Engineered Skin Substitutes in Perfusion Culture. Tis Eng: Part A. 2008,14(5):583-93)已设计了一种生物反应室，进、出水口管是从培养室的底面两侧分别接入培养室，通过设置出液管的高度来控制培养室液面的高度，即培养室液面高于出水管后液体将溢进管子而流出，通过对构建的组织工程皮肤进行熟化培养，结果表明在灌注速度为5ml／min或15ml／min培养条件下，组织学结构好于静态培养，其中，通过细胞活力检测结果表明，在5ml／min的灌注速度下的细胞活力明显好于静态培养下的细胞活力；采用BrdU掺入法检测细胞的增生情况也表明，在灌注速度5ml／min或15ml／min时的细胞增生情况明显好于静态培养下的细胞增生情况。对比还发现灌注速度50ml／min时只显示少量细胞增生，实验研究证明了低流速能够增加细胞活力和维持表皮的屏障，适合于移植，而高流速产生高的剪切力则可导致细胞的变性坏死。

尽管现有的灌注式培养装置简单地实现了液体的循环，但却没有考虑流场的整体情况，一方面，因培养液在循环过程中流速不稳定，变化频繁，无法保证在流经待培植组织工程产品时处于低流速的均匀流场，对细胞增生不利；另一方面，处于边缘的培养液不易流动，培养装置内流场不均一，营养传递不均,容易造成细胞生长不均匀；况且，在流速不均的情况下液体对细胞所施加的剪切力大小不同，流速快时剪切力过大而使细胞易受到损伤，流速过低（接近静止）时又不利于细胞增生。本发明人在第三军医大学学报第35卷第7期《基于准静态平面流场的新型皮肤组织工程灌注式生物反应室设计与初步模拟》中公开了一种灌注式生物反应器，包括培养基瓶、蠕动泵、无菌硅胶管、缓冲槽、溢流坝、培养室和泄流沟。该生物反应器是培养液通过溢流的方式来实现准静态平面流场，培养液进入缓冲槽，经高溢流坝溢流进入培养室，从而在培养中对组织细胞进行供养，然后培养液经低溢流坝溢出至泄流沟，最后培养液进入到下一层反应器缓冲槽中。利用这种生物反应器，由于培养液存在表面张力，流入缓冲槽的流速不恒定和不均匀所造成的压头不稳定，加之高溢流坝的泄流斜面不可能处于绝对平整，所以培养液在缓冲槽积蓄势能后流经高溢流坝的泄流斜面时，形成一股或几股不均匀的流液，更有甚者，在较低流速下泄流斜面的某些区域形成了断流以致培养基在进入培养段流场时出现了不均匀的流场，造成某些区域的细胞得不到或得到很少的营养物质以及不能及时排除代谢产物而出现损伤或者死亡；而且现有的筛网大多固定在反应室的底壁上，必定需要一定的支架用来固定筛网，由此就会造成在流场方向上，固定筛网架的支柱后侧不能形成均匀的流场也会对部分培养区域造成一定的影响。

由此可见，在灌注式培养中，使流经待培育组织细胞的液体流场均匀，流速始终保持在低流速，对提高组织工程产品质量、缩短培植时间、提高培育效率至关重要。

发明内容