[发明专利]一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种大黄鱼鱼鳞蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQ ID No:1），分子量为m/z 631.70 Da。

2.一种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将大黄鱼鱼鳞用自来水洗净，按照固液比1 g:10~15 mL加入2~3%盐酸处理20~24 h，过滤除去盐酸后按照固液比1 g:10~15 mL加入0.08~0.1mol/L NaOH处理20~24 h；过滤，蒸馏水洗至pH 6.5~7.5，30~35 ℃干燥后用粉碎机粉碎；

2）取粉碎后鱼鳞粉末，按照料液比1 g: 8~10 mL加入缓冲液，调节pH 值至9. 0 ~ 10.0，于45~50 ℃保温5~10 min；

3）按照鱼鳞质量1.5~2.0%加入蛋白酶，于45~50 ℃温度下酶解4~6 h，将酶解液加热到90~95℃灭活5~10 min，4500~5000 r/min离心10~15 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化胶原肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的缓冲液为pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.8×10⁶ U/g。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：

超滤：将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.10 ~ 0.15 MPa的工作压力和20~25 ℃的工作温度下采用分子量1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液；

层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，羟基自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用羟基配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQ ID No:1）。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52 cellulose，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15；所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21 μg；色谱柱为Kromasil C18；柱温为室温；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~35 min乙腈浓度从0至50%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。

7.一种权利要求1所述的大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽的应用，其特征在于Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQ ID No:1）对DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQ ID No:1）亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQ ID No:1）具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂上应用。