[发明专利]1‑氨基‑2‑萘酚作为β‑萘酚源染料半抗原的应用

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体涉及以β-萘酚为结构母核的红色偶氮染料族特异性人工抗原和广谱特异性单克隆抗体的结构和制备方法。

背景技术

偶氮类红色染料是一类采用化学方法合成的含有偶氮键的红色染料，主要用于工业和印染业中。在所有红色染料中，很多品种是以β-萘酚为核心结构，将其与含有苯胺结构的不同化合物进行偶合而制得的，常见品种有酸性橙2号、苏丹红1号、苏丹红2号、苏丹红3号、苏丹红4号、对位红、苏丹红G、苏丹红B等。现已证明在这些红色偶氮染料中，有一些品种（如苏丹红1号）可以造成人和动物的癌症，因此被世界癌研究组织列为第3类致癌物。同时，这些染料可以被人类肠道中的多种细菌还原为有致癌性的芳香胺类物质。也就是说，这些红色偶氮染料存在/残留于食品中会对人体健康产生很大危害。因此，世界多国均明令禁止将这些红色偶氮类染料作为食品着色剂使用。然而，由于其有较强的着色力，许多食品加工企业仍将这些染料非法用于辣椒产品、番茄产品的着色，甚至添加到禽类饲料中以产出蛋黄颜色较深的“红心蛋”，这对人类健康造成严重威胁。

目前，已有多种仪器方法可用于检测食品中的这些红色偶氮染料。与仪器方法相比，免疫检测法具有廉价、灵敏、快速，一次检测样本量大等多种优点。虽然目前已有文献报道采用免疫法对这些红色染料进行检测，但这些方法均是以某一种染料的原形为分子模板来制备抗体，所得到的抗体也只能识别相应的染料，或只能识别少数几种同类染料，且交叉反应率差别较大。也就是说，目前还没有能同时检测前述8种β-萘酚源红色偶氮染料的免疫检测方法。

免疫分析法的核心试剂是抗体。要建立一种可同时检测这些含β-萘酚结构的红色偶氮染料的免疫法，前提是要获得能同时识别这些染料的抗体。如前所述，这些红色偶氮染料均是β-萘酚的衍生物，在它们的分子结构中均含有一个独立的β-萘酚环状结构，且这一β-萘酚环均位于这些红色染料分子结构的一端。因此，β-萘酚是这些红色染料的母核结构，针对β-萘酚的特异性抗体能同时识别这些β-萘酚源红色染料。但是目前还少见能够同时检测多种红色偶氮染料免疫检测试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种已知化合物1-氨基-2-萘酚作为β-萘酚源染料半抗原的应用，并由此制备相应的β-萘酚源染料的人工抗原和单克隆抗体，同时还提供该单克隆抗体对多种β-萘酚源染料的免疫检测应用。

为实现上述发明目的，本发明采取以下系列技术方案：

1-氨基-2-萘酚作为β-萘酚源染料半抗原的应用。1-氨基-2-萘酚是一种已知化合物，其环式结构与β-萘酚源红色偶氮染料母核的环式结构相同，而且上面的氨基又便于发生化学反应与载体蛋白相连，具有很好的作为半抗原的条件，这一点现有技术未能涉及。

一种β-萘酚源染料的人工抗原，其结构如式Ⅰ所示：

Ⅰ。

优选的，式Ⅰ中的载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。

上述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

（a）将1-氨基-2-萘酚溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌溶解得溶液A，将所述载体蛋白溶解于磷酸二氢盐和磷酸氢盐组成的缓冲溶液中，得溶液B；

（b）将所述溶液A滴加至所述溶液B中，充分搅拌得到溶液C；

（c）向溶液C中逐滴加入质量分数为20~30%的戊二醛水溶液，搅拌，室温反应4~5小时后，3500~4500转/分钟离心4~8分钟；

（d）将步骤（c）所得液体置于透析袋中，在4~20℃用磷酸二氢盐和磷酸氢盐组成的缓冲溶液透析3~4天，得到式Ⅰ所示的人工抗原。

一种β-萘酚源染料的单克隆抗体，是能与式Ⅰ所述人工抗原发生特异性免疫反应的免疫球蛋白，制作方法包括如下步骤：

（a）以式Ⅰ结构的人工抗原作为免疫原，免疫5只Balb/C小鼠，免疫剂量为100-300μg/只，免疫方法如下：将免疫原与等量弗氏完全佐剂充分乳化，在颈背部皮下多点注射，间隔2-3周，将免疫原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，加强免疫一次，共加强免疫6次；

（b）最后一次免疫后7天，选取上述血清效价最高的小鼠脱颈椎处死，无菌条件下，取出脾脏，分离脾细胞，按10：1的比例与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，用β-萘酚为标准抑制物筛选阳性杂交瘤细胞，然后采用有限稀释法获得分泌抗β-萘酚单克隆抗体的单株杂交瘤细胞；