[发明专利]检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒

权利要求书

1. 猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白，其制备方法包括以下步骤：

（1）以猪流行性腹泻病毒PEDV的RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N基因，基因登录号KC210145，扩增片段大小为1326bp，并以pET-28a质粒作为载体构建重组质粒pET-28a-N，N基因与pET-28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET-28a-N，双酶切鉴定重组质粒；

将阳性重组表达质粒pET-28a-N转化BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET-28a-N/BL21；该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定，取诱导表达后5h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni-TED柱进行纯化，收集上清滤过液、LEW洗涤Ni-TED柱所得洗涤液、1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。

2.用权利要求1所述PEDV重组N蛋白制备的猪流行性腹泻病毒抗体检测ELISA试剂盒，包括以下组分：

（1）ELISA板条：以权利要求1所述PEDV重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经5%（M/V）脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4℃保存；

（2）洗涤液：含0.05%吐温-20的pH7.4 磷酸盐缓冲液PBS-T；

（3）血清稀释液：5%（M/V）脱脂乳；

（4）底物显色液：已加入H₂O₂的TMB溶液；

（5）羊抗猪酶标二抗：已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二抗；

（6）终止液：2M H₂SO₄溶液；

（7）PEDV阳性血清；

（8）PEDV阴性血清。

3.根据权利要求2所述ELISA试剂盒，其在检测猪流行性腹泻病毒抗体时，主要操作步骤如下：

（1）加入血清样品：

用血清稀释液5%（M/V）脱脂乳将待检血清做1:50稀释后，每孔加入100μL，每一血清样品添加两孔，同时设立PED阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用60分钟，弃去反应孔中的液体：每个孔用200μL洗涤液充分清洗3次，每次5分钟，每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体；

加入羊抗猪酶标二抗：

每孔加入100μL羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，如步骤（1）中方法洗涤；

加入底物显色液：

每孔加入100μL已加入H₂O₂的TMB溶液，室温下避光作用15分钟；

终止反应：

每孔加入100μL 2M H₂SO₄终止液，终止显色反应；

用酶标仪测定OD值：

使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度（OD）值；

结果判定：

间接ELISA检测时加入标准阳性血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，计算各份血清OD₄₅₀与标准阳性血清OD₄₅₀的比值S/P，当样品S/P值≥ 0.26时为阳性，＜0.26时为阴性。