[发明专利]用于检测肺炎支原体23S rRNA突变的特异性引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及引物和探针技术，特别涉及一种用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的特异性引物和探针。 

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是介于细菌与病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞型生物。能在体外生存而不依靠活细胞，能够自我复制。主要通过呼吸道传播，儿童和青年人易感，一般为散发或小流行，一年四季均可发病，多在秋季暴发，流行趋势为每3-7年在全球流行，在人群密集处如学校发病率高，在家庭成员中易相互传染。从近年来流行的报道可以看出MP肺炎发病率有上升趋势，占各类肺炎总数的8.5％-27.9％，而且在小年龄儿童呼吸道感染中也较常见，MP对人类健康的威胁已不容忽视。重症肺炎支原体肺炎表现为大量胸腔积液、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺纤维化、阻塞性细支气管炎等，而且常常伴随肺外表现，如脑炎、心肌炎、肝炎、肾炎等，严重威胁儿童的身心健康，甚至危及生命，早期诊断和治疗显得非常重要。MP缺乏细胞壁这一结构特点，使其对影响细胞壁合成的抗生素具有本质耐药性。临床治疗MP感染主要选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物，如大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类。由于儿童处于生长发育期，能够用于治疗儿童MP感染的药物选择更少，目前首选大环内酯类药物，主要为14元环的红霉素和15元环的阿奇霉素。而四环素类、氨基糖苷类和喹诺酮类由于副作用的原因，已极少用于儿科临床。随着大环内酯类抗生素的广泛使用，已有越来越多关于MP对大环内酯类抗生素耐药的报道。我们在临床上也常发现大环内酯类药物治疗无效的病例，这些病例经大环内酯类抗生素治疗后，体温不降，咳嗽和肺部炎症无好转，易合并胸腔积液和肺不张，需要调整药物治疗。细菌药物研究较早，有了很多发现。但由于MP生长缓慢、培养周期长和需要特殊培养基，体外分离培养比较困难，以往MP感染的诊断多依赖血清学检查，因此药物敏感性研究报道较少。 

目前，临床上对肺炎支原体耐药性的检查，主要是依靠肺炎支原体的分离及药敏实验，由于肺炎支原体分离较为困难，所以灵敏度较低，而且耗时耗力，不利于及时指导用药。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的引物和探针。 

为解决技术问题，本发明的解决方案是： 

提供一种用于检测肺炎支原体23S rRNA突变的特异性引物，该引物是用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的引物，具体包括： 

上游引物MPF，其序列为SEQ NO.1：5’CGTGAGTTGGGTTCAA3’； 

下游引物MPR，其序列为SEQ NO.2：5’CTTCGGTCCTCTCGTA3’。 

本发明还提供了用于检测肺炎支原体23S rRNA突变的特异性探针，该探针是用于检测肺炎支原体23S rRNA2617位点C:A突变的探针2617P，其序列为SEQ NO.3：5’FAM ACAGGTTGGTCACTATCTATTG BHQ13’。 

本发明进一步提供了检测肺炎支原体23S rRNA突变的方法，是利用前述的引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，通过PCR实现靶核酸序列片断的扩增；所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸；在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号能够被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在；具体的判断依据为： 

如果待检样本中含有发生2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度能够达到1000拷贝/mL；如果待检样本中没有2617位点C:A突变的肺炎支原体，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号。 

与现有技术相比，本发明的有益效果在于： 

1、本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/mL，说明其灵敏度良好。 

2、本发明提供的引物和探针对不含2617位点C:A突变的肺炎支原体的样本没有检测信号，说明其特异性强。 

3、由于本发明是针对2617C:A突变位点，进行了程序和体系优化，避免了假阴性和假阳性结果的出现。