[发明专利]一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物农药制造技术领域，具体涉及到一种放线菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法。

背景技术

微生物来源的活性化合物是高效低毒农用抗生素的主要来源，以微生物代谢产物研制开发的抗生素是生物农药的重要组成部分,也是世界农药开发的主要研究方向。

我国农用抗生素的研究起步较早，早期，我国成功研制了春雷霉素，庆丰霉素，井岗霉素，多抗霉素，公主霉素，多效霉素，农抗120等。近十多年来，一些新的农用抗生素如中生霉素，武夷霉素，宁南霉素、华光霉素、嘧肽霉素等获得开发。目前，我国农用杀菌剂产品除了井冈霉素外，进入实用化的还有春雷霉素、农用链霉素、宁南霉素等有限的几种，作为杀菌剂的抗生素类生物农药品种非常少，产业化水平较低，远不能满足市场需求。

新型核苷二肽类农用抗生素新奥霉素由一株诺尔斯链霉菌的发酵液中分离得到的。具有广谱的抗植物病毒病和细菌病害的活性尤其对革兰氏阳性菌、植物病毒的抑制活性很强。

在国内多个省、地区进行了小区和大田应用示范等试验，表明对烟草、辣椒、番茄花叶病毒病等具有很强的抗植物病毒病活性，还能够防治水稻白叶枯病、青枯病、软腐病等细菌病害，抗菌作用谱广。新奥霉素制剂毒理学试验结果表明属于微毒。产新奥霉素的链霉菌经多轮诱变选育，已获得了一株有产业化价值的高产菌株，并且，新奥霉素发酵生产技术及放大发酵生产技术已比较成熟。相对链霉菌发酵产物来说，在发酵产物中活性物质新奥霉素的量还是很低的，加之在发酵液中还存在与新奥霉素共存的其它大量杂质和副产物，如微生物细胞、蛋白质、色素、其它细胞代谢产物及末用完的培养基，因此，从发酵液中提取新奥霉素是一个比较复杂的过程。，

由于微生物发酵产生新奥霉素类的嘧啶核苷二肽的产量一直比较低，因此，近20年来，微生物学家研究的重点主要侧重于与用微生物发酵生产嘧啶核苷二肽类抗生素的方法，有关从微生物发酵液中提取嘧啶核苷二肽类抗生素的工作开展得不多。发明专利ZL200910060121.4公开了涉及微量新奥霉素样品(mg级)的制备技术,包括新奥霉素发酵结束后，通过添加2-4倍发酵液体积的甲醇或乙醇，从上述发酵培养液中收集新奥霉素，再通过正相硅胶层析和反相硅胶层析分离，得到的新奥霉素样品，用高效液相色谱进一步分离纯化，制备得到微量的新奥霉素。该提取技术方法步骤繁琐，耗用大量的有机溶剂，提取周期长，活性损失大，不适合大量新奥霉素的制备。发明专利ZL201110261822.1公开了的硅胶层析三元洗脱体系改变为二元洗脱体系的提取技术方法，并去掉了反相硅胶层析分离和高效液相色谱纯化步骤，具有耗用有机溶剂少等优点，但硅胶柱的再生和使用次数使放大生产受到了一定的限制。目前，非常缺乏从发酵液中提取新奥霉素的发酵工程下游技术。

为了解决现有新奥霉素提取技术的不足，在充分进行了新奥霉素发酵产物理化性质研究的基础上，本发明提出了一种新的从链霉菌发酵代谢产物中提取新奥霉素的技术方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种链霉菌发酵液中新奥霉素的富集及分离提取方法，建立一种新奥霉素发酵工程下游提取技术，并且容易放大生产，而且分离效果好，产品收率高。

为达到上述目的，本发明的具体技术方案是：提供一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，该方法包括以下步骤：

(1)将能发酵产生新奥霉素的一株诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)的遗传改良菌株“诺尔斯链霉菌XiAo-3”接种到发酵培养基中进行液体深层培养得到含有新奥霉素的发酵液，首先将发酵液先加热升温至60℃-80℃进行杀菌处理，再用滤布过滤或采用陶瓷微滤膜除去上述发酵液中的培养基固形物和菌体杂质，得到预处理发酵液；

(2)用大孔吸附树脂处理步骤(1)中得到的预处理发酵液得到吸附树脂处理液；

(3)使用阳离子树脂富集分离吸附树脂处理液中的新奥霉素：将步骤(2)得到的吸附树脂处理液均速流过装有大孔阳离子树脂的离子交换柱，控制吸附树脂处理液的流速使吸附树脂处理液与大孔阳离子树脂的接触时间为90min-180min，当交换后流出液中新奥霉素的生物活性单位达到原始发酵液活性单位的5-10％时停止继续进吸附树脂处理液，得到吸附达到饱和的树脂；

(4)解析：将步骤(3)吸附饱和的树脂用洗脱剂进行解析得到解析液；

(5)用硫酸或盐酸将步骤(4)得到的解析液的pH值调至7后，再浓缩到新奥霉素含量大于12％以上，配制成浓度为8％-12％的新奥霉素农药母液；或再添加载体烘干制成粉剂。