[发明专利]一种去蛋白脱钙骨基质植入型微载体的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种去蛋白脱钙骨基质植入型微载体的制备方法及应用。

背景技术

目前种子细胞的使用主要以自体细胞为主，但其可获取量太少，远远不能满足临床使用所需，因此需要在体外进行扩增，待达到所需数目后进一步完成组织工程骨的构建。在种子细胞的体外扩增方面，今年来以微载体在动态悬浮培养条件下的培养效果较为优越且得到广泛认可。

但是，目前使用较为广泛的、可作为同类产品考量标准品的微载体选择主要为Cytodex系列产品，其中以Cytodex3应用较为广泛，该产品为人工合成的含变性蛋白表面包被的右旋糖酐颗粒，具有良好的细胞粘附性及均质性；其细胞培养效率高，可在短时间内大量扩增种子细胞用于疫苗、辅酶等的批量生产，或大量扩增干细胞等种子细胞并经消化分离后收集以用于组织工程构建。但是，Cytodex类产品均为人工合成材料，多为不可降解材料，无法直接用于体内组织修复过程，导致经微载体培养扩增的种子细胞不能直接以微载体为体内移植载体而植入体内。大量实验结果表明，额外的细胞消化分离过程会破坏胞外基质，从而造成细胞活性的丧失及细胞数目的浪费。在解决上述问题的过程中，研究者们试图通过改良细胞获取手段、优化微载体材料及制备等方法来提高细胞利用率及有效率，但大都因为细胞活性降低或体内局部酸累积无明显改善而终止，导致可直接用于体内移植的微载体材料尚较为缺乏。

为了得到质地统一、可控性好的微载体颗粒(微载体的基本要求之一)，在微载体制备过程中多采用人工合成材料及方法来进行微载体加工，这将势必造成微载体材料在体内的降解性差或不可降解，因而不能作为体内植入材料来应用于种子细胞的体内移植载体，导致种子细胞在经微载体培养扩增后仍需进行消化分离以进行其与移植支架材料的再贴壁过程。总而言之，在现行的微载体制备思路下，采用人工合成材料制备的微载体颗粒将很难作为种子细胞的移植载体，由其培养扩增所得的种子细胞将不可避免的进行再消化分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种去蛋白脱钙骨基质植入型微载体的制备方法及应用，制备出可用于体外动态悬浮培养条件并大量扩增种子细胞的微载体。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种去蛋白脱钙骨基质植入型微载体在制备组织工程材料方面的应用。

所述组织工程材料为修复腔隙状组织缺损区的组织工程材料。

所述组织工程材料为修复大段骨缺损的组织工程材料。

一种去蛋白脱钙骨基质植入型微载体的制备方法，将牛皮质骨进行冷冻粉碎后，筛出粒径小于200um的骨颗粒，并对骨颗粒进行脱脂、脱钙和脱蛋白处理，得到去蛋白脱钙骨基质植入型微载体。

所述冷冻粉碎前将牛皮质骨在-80℃保存24h以上。

所述脱脂具体过程为：向脱脂液中加入骨颗粒并持续搅拌2-3h后用蒸馏水冲洗骨颗粒，然后把冲洗后的骨颗粒加入到脱脂液中，持续搅拌2-3h，其中每3mL脱脂液中加入0.8-1.2g骨颗粒，脱脂液为甲醇与氯仿体积比为1:1的混合物。

所述脱钙具体为：将骨颗粒加入到0.5-0.6mol/L的盐酸中，持续搅拌8-12h，然后将骨颗粒取出，然后重复上述过程2-3次；其中，每3mL盐酸中加入骨颗粒的质量为0.8-1.2g。

所述脱蛋白处理具体为：室温下，将脱钙处理后的骨颗粒，依次置于2-3mol/L的CaCl₂溶液搅拌16-24h，0.5mol/L的EDTA溶液中搅拌4h，8mol/L的LiCl溶液中搅拌16-24h，然后在52℃的水浴下加热4-6h，再用6mol/L脲素溶液抽提36-48h，水洗后收集颗粒，并经过冻干处理；其中，所用2mol/L的CaCl₂溶液、0.5mol/L的EDTA溶液、8mol/L的LiCl溶液、6mol/L脲素溶液的体积为脱钙处理后的骨颗粒质量的2-3倍。